Monique Egler

Rolle von RpoE-homologen Sigmafaktoren in der Schwermetall-Homöostase von Escherichia coli und Cupriavidus metallidurans

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 20.12.2005

Abstract
Sigmafaktoren dienen als Untereinheit der RNA-Polymerase (RNAP) in Bakterien der Erkennung verschiedener Transkriptionsstartpunkte. Mit Hilfe der ECF- (extracytoplasmic function) Sigmafaktoren ist die Zelle in der Lage, durch gezielte Genexpression, spezifisch auf Schädigung des Periplasmas und der äußeren Membran zu reagieren. Bisher war wenig über die Zusammenhänge von Schwermetall-Stress und ECF-Sigmafaktoren bekannt, deshalb wurde dieser Aspekt der zellulären Regulation genauer untersucht. Als Untersuchungsobjekte dienten das Schwermetall-resistente Bakterium C. metallidurans sowie der Modellorganismus E. coli. Im Gegensatz zu C. metallidurans war die Transkription von rpoEEc in E. coli durch Metallionen, vor allem Zn(II) und Cu(II) induzierbar. In beiden Bakterien führte die Deletion des Gens für den ECF-Sigmafaktor zu metallsensitiven Mutanten.
Es konnte gezeigt werden, dass RpoECm-RNAP in der Lage ist, an die Promotoren von rpoECm, cadA und zntACm zu binden und von ihnen ausgehend in vitro eine Transkription zu starten. Ob RpoECm auch in vivo an der Expression der Zn/Cd-translozierenden P-Typ-ATPasen CadA und ZntACm beteiligt ist, konnte bisher nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden.
In E. coli konnten zwei neue Mitglieder des RpoE-Regulons, das cytoplasmatische Regulatorprotein CueR und die periplasmatische Multicopper-Oxidase CueO, identifiziert werden. In β-Galaktosidase-Assays zeigte sich, dass die Expression von cueR und cueO oberhalb von 1.5 mM CuCl2 σE-abhängig verläuft. Oberhalb dieser Schwellenkonzentration benötigt E. coli entweder RpoEEc oder CueO oder das Cus-System, um die Integrität der bakteriellen Hülle aufrechtzuerhalten.

Bacteria employ sigma factors as subunit of RNA polymerase (RNAP) for recognition of different transcription starts. Using ECF (extra cytoplasmic function) sigma factors enables the bacterial cell to respond with targeted gene expression to damage of bacterial envelope. So far, little was known about connection of heavy metal stress and ECF sigma factors so far. Therefore this aspect of cellular regulation was studied in more detail. The heavy metal resistant bacterium Cupriavidus metallidurans and the model organism Escherichia coli were chosen as research objects. In contrast to C. metallidurans, transcription of rpoEEc in E. coli was inducible by metal ions, especially Zn(II) and Cu(II). Deletion of the ECF sigma factor encoding gene results in metal sensitive phenotype in both bacteria.
It could be demonstrated that RpoECm-RNAP is able to bind the promoters of rpoECm, cadA and zntACm and to initiate transcription of them in vitro. Involvement of RpoECm in expression of Zn/Cd translocating P type ATPase CadA and ZntACm in vivo could not be clearly demonstrated.
In E. coli two new members of σE regulon, the cytoplasmic regulator CueR and the periplasmic multi copper oxidase CueO, could be identified. In β galactosidase assays expression of cueR and cueO was σE dependent above concentrations of 1.5 mM CuCl2. Above this threshold concentration E. coli requires either RpoEEc or CueO or Cus system to maintain integrity of bacterial envelope.

Keywords:
RpoE, extra cytoplasmic function, ECF-Sigmafaktor, Schwermetall-Homöostase, Escherichia coli, Cupriavidus metallidurans, Regulation

RpoE, extra cytoplasmic function, ECF sigma factor, heavy metal homeostasis, Escherichia coli, Cupriavidus metallidurans, regulation

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1, I-VI)
1 Einleitung (1-7)
2 Material und Methoden (8-38)
3 Ergebnisse (39-68)
4 Diskussion (69-90)
5 Zusammenfassung (91)
6 Literatur (92-105)
Anhang (106-110)