Ding Li

Molecular attempts to alter carbon partitioning towards the synthesis of phenolic compounds in transgenic tobacco plants

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 18.02.2005

Abstract
Innerhalb des Shikimatstoffwechsels katalysiert das bifunktionelle Enzym 3-Dehydroquinat-Dehydratase / Shikimat-Dehydrogenase (DHD/SHD) die reversible Überführung von Dehydroquinat in Shikimat. Ungeachtet der zentralen Rolle des Enzyms ist wenig über die biochemischen Eigenschaften bzw. die in planta Funktion des Enzyms bekannt. Um die in planta Funktion des Enzyms aufzuklären, wurde die Enzymaktivität mittels RNAi-Strategie in transgenen Tabakpflanzen gehemmt und die Konsequenz verminderter DHD/SHD Aktivität auf den Pflanzenstoffwechsel und den Pflanzenwuchs ermittelt. Erhebliche Wachstumseinbußen der transgenen Pflanzen traten bei einer 60%igen Hemmung der Enzymaktivität auf. Als Folge des inhibierten Shikimatstoffwechsels konnte eine verminderte Akkumulation von sekundären Pflanzeninhaltstoffen (z.B. Lignin, Chlorogensäure) und aromatischen Aminosäuren in den transgenen Pflanzen beobachtet werden. Überraschenderweise kam es in den transgenen Pflanzen neben einer Akkumulation des Substrates (Dehydroquinat) auch zu einem Anstieg des Produktes (Shikimat) der Enzymreaktion. Durch den Einsatz induzierbarer RNAi konnte nahegelegt werden, dass zunächst der Dehydroquinatgehalt und anschließend der Shikimatgehalt ansteigt. Dieser unerwartete Anstieg könnte durch eine Hemmung des weiteren Shikimatstoffwechsels oder eine Shikimat Synthese außerhalb der Plastiden erklärt werden. Um diese Hypothesen zu überprüfen wurden (i) Shikimatfütterungsversuche, (ii) eine detaillierte Expressionsanalyse sowie die (iii) Klonierung einer möglichen cytosolischen DHD/SHD Isoform durchgeführt. Unter der Annahme, dass Dehydroquinat aus den Plastiden transportiert werden und anschließend durch ein cytosolisches DHD/SHD Isoenzym in Shikimat überführt werden könnte, wurde nach weiteren DHD/SHD kodierenden cDNAs gesucht. Basierend auf Datenbankvergleichen und der Klonierung einer weiteren DHD/SDH kodierenden cDNA konnten erste Hinweise auf die Existenz einer cytosolischen DHD/SHD Isoform erhalten werden. Die Kodierregion der als NtDHD/SHD-2 bezeichneten Isoform verfügt über kein plastidäres Transitpeptid und führt nach transienter Expression in Tabakblättern zu einer starken Erhöhung der cytosolischen DHD/SHD Aktivität.
In einem weiteren Ansatz wurde versucht zu ermitteln, ob die Verfügbarkeit von PEP in Plastiden die Synthese phenolischer Inhaltstoffe limitiert. Zu diesem Zweck wurden die Kodierregionen der E. coli Enzyme PGM (Phosphoglyceromutase) and Enolase mit einer plastidären Transportsequenz fusioniert und in transgenen Tabakpflanzen exprimiert. Durch die Koexpression beider Enzyme sollte plastidäres 3-Phosphoglycerinsäure (3PGA) in zwei Schritten in PEP überführt werden. Subzelluläre Fraktionierung erbrachte den Nachweis, dass beide Enzymaktivitäten in die Plastiden transportiert wurden. Als Folge der ektopischen Expression konnte erwartungsgemäß eine Verminderung der 3PGA und eine Steigerung der PEP Gehalte beobachtet werden. Dies führte nicht zu einer Erhöhung phenolischer Inhaltstoffe, aber zu einer Hemmung der Photosynthese und einem verminderten Wuchs der resultierenden Pflanzen.

Within the shikimate pathway the bifunctional enzyme 3-dehydroquinate dehydratase / shikimate dehydrogenase (DHD/SHD) catalyzes the reversible conversion of dehydroquinate into shikimate. Despite its central function within the shikimate pathway, little is known about its biochemical characteristics or its in planta importance. To elucidate the in planta function of DHD/SHD enzyme, enzyme activity was strongly decreased by RNAi (RNA interference) in transgenic tobacco. Plants with suppressed DHD/SHD activity below 40 % of the wild type level displayed severe growth retardation. Secondary metabolites (chlorogenic acid and lignin) and aromatic amino acids decreased in transgenic plants. Surprisingly, silencing of DHD/SHD enzyme resulted in an accumulation of dehydroquinate (substrate) and shikimate (product) in transgenic plants. To investigate kinetics of shikimate and dehydroquinate during the silencing of DHD/SHD, an ethanol inducible silencing construct alc-DHD/SHD-RNAi was created. The induced silencing of DHD/SHD led to an early accumulation of dehydroquinate and a late accumulation of shikimate in the leaves of transgenic plants. This result strongly suggested that the accumulation of dehydroquinate is a direct consequence of the silencing of DHD/SHD, whereas the buildup of shikimate is derived from secondary effects. This leads us to put forward a model to interpret the buildup of shikimate in transgenic plants. We assume that a certain amount of dehydroquinate would be transported from chloroplasts to the cytosol, and be converted to shikimate by a cytosolic isoform of DHD/SHD. The cytosolic shikimate most likely is not efficiently re-imported into chloroplasts, thus further metabolism is impaired. The isolation of a full-size cDNA encoding a putative DHD/SHD isozyme (Nt-DHD/SHD-2) supports this hypothesis. Lacking a typical chloroplast transit peptides, Nt-DHD/SHD-2 was judged to be a cytosolic enzyme. Transient expression using Agrobacterium infiltration confirmed the enzyme activity and cytosolic localization of Nt-DHD/SHD-2.
PEP is one of the substrates of the shikimate pathway. Because most plastids have little or no PGM (phosphoglycerate mutase) and enolase activity, 3-phosphoglycerate (3-PGA) cannot be metabolized to PEP in plastids. Plastids rely on the supply of cytosolic PEP via a shuttle mechanism. By introducing PGM and enolase into chloroplasts, we created a plastic PEP biosynthetic pathway. Under the subsequent catalyses of PGM and enolase, plastidic 3-PGA was converted to PEP in situ. As a result, PEP and pyruvate content increased substantially, whereas 3-PGA levels decreased dramatically in leaves of transgenic tobacco plants. This genetic manipulation led to many detrimental consequences in transgenic plants, including retarded growth, repressed photosynthesis and reduced production of carbohydrates. Unexpectedly, the elevated supply of PEP to plastids did not significantly enhance carbon flux into the shikimate pathway and secondary metabolism.

Keywords:
Shikimatstoffwechsels, RNAi, 3-Dehydroquinat-Dehydratase / Shikimat-Dehydrogenase, EPSP synthase, Shikimat, Dehydroquinat

shikimate pathway, RNAi, 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate dehydrogenase, EPSP synthase, shikimate, dehydroquinate

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Inhaltsverzeichnis
Title page, Contents (2, I-V)
1 Introduction (1-14)
2 Materials and methods (15-25)
3 Results (26-80)
4 Discussion (81-92)
5 Summary (93-95)
6 Zusammenfassung (96-98)
7 Abbreviations (99)
8 References (100-109)
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