Anja Ebert

Su(var)-Gene regulieren die Balance zwischen Euchromatin und Heterochromatin in Drosophila melanogaster

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 02.11.2005

Abstract
Lysin-Methylierung an N-terminalen Enden von Histonen stellt eine wichtige epigenetische Markierung für die Determinierung bestimmter chromosomaler Domänen dar. In Drosophila melanogaster wird H3-K9 di- und tri-Methylierung hauptsächlich durch die Heterochromatin-assoziierte HMTase SU(VAR)3-9 kontrolliert, einem dominanten Suppressor der Positionseffekt-Variegation (PEV). Demgegenüber werden alle H3-K27 Methylierungsstadien unabhängig von dem Pc-Gruppenprotein E(Z) vermittelt. In Su(var)2-5 Null-Mutanten ist in Übereinstimmung mit der ektopischen Verteilung von SU(VAR)3-9 die H3-K9 mono- und di-Methylierung im Euchromatin drastisch erhöht. Gleichwohl bleibt die Verteilung der H3-K9-Methylierungsstadien innerhalb des perizentrischen Heterochromatins unverändert. Genetische bzw. immunzytologische Analysen von 19 Punktmutanten demonstrieren, daß sich das Silencing-Potential von Su(var)3-9 proportional zur dazugehörigen HMTase-Aktivität verhält. Die hypermorphe Punktmutante Su(var)3-9ptn weist massiv erhöhte H3-K9 di- und tri-Methylierung sowohl im Euchromatin als auch im Heterochromatin bei gleichzeitig verstärktem Gensilencing auf.
Su(var)3-9-Mutanten weisen schwerwiegende chromosomale Instabilitäten während der schnellen syncytialen Kernteilungen in frühen Embryonen auf, die mit dem Verlust der HMTase-Aktivität assoziiert sind.
SU(VAR)3-9-abhängige H3-K9-Methylierung ist die Voraussetzung für H4-K20 tri-Methylierung durch SUV4-20. Die Notwendigkeit von HP1 für die Etablierung der H4-K20 tri-Methylierung legt einen nacheinandergeschalteten Mechanismus für den Aufbau der H3-K9 und H4-K20-Methylierung im perizentrischen Heterochromatin nahe. Der Befund, daß Suv4-20 einen Suppressor auf PEV darstellt, untermauert die Funktion der H4-K20 tri-Methylierung als repressive Markierung chromosomaler Domänen.
Mutationen in einem neuen Su(var)-Gen, Su(var)3-1, schränken massiv Su(var)3-9-vermitteltes Gensilencing ein. Su(var)3-1-Allele, die als antimorphe Mutationen der H3-S10 Kinase JIL-1 identifiziert werden konnten, behalten die H3-S10 Kinase-Aktivität und weisen keine globalen Veränderungen innerhalb repressiver bzw. aktivierender Histon-Modifizierungen auf. Gleichwohl demonstrieren Analysen mit sieben unterschiedlichen PEV-Rearrangements eine allgemeine Funktion von JIL-1Su(var)3-1 in der Blockierung der Ausbreitung heterochromatischer Strukturen. Diese Daten legen die Existenz einer dynamischen Balance zwischen Euchromatin und Heterochromatin nahe.

Histone lysine methylation is an epigenetic mark to index chromosomal subdomains. In Drosophila, H3-K9 di- and trimethylation is mainly controlled by the heterochromatic SU(VAR)3-9 HMTase, a major regulator of position-effect variegation (PEV). In contrast, all H3-K27 methylation states are independently mediated by the Pc-group enzyme E(Z). Analysis of 19 point mutants demonstrates that the silencing potential of Su(var)3-9 increases with its associated HMTase activity. A hyperactive Su(var)3-9 mutant, pitkin(D), displays extensive H3-K9 di- and trimethylation within but also outside pericentric heterochromatin.
Su(var)3-9 mutants display severely chromosomal instabilities during early embryogenesis that are associated with perturbed HMTase activity.
SU(VAR)3-9-dependent H3-K9 methylation is required for the induction of H4-K20 trimethylation mediated by SUV4-20. The absence of H4-K20 trimethylation in HP1 null mutants suggests a sequential mechanism to establish H3-K9 and H4-K20 trimethylation at pericentric heterochromatin. The classification of Suv4-20 as a dominant Suppressor of PEV further indicates a functional role for Suv4-20-dependent H4-K20 trimethylation in gene silencing.
Notably, mutations in a novel Su(var) gene, Su(var)3-1, severely restrict Su(var)3-9-mediated gene silencing. Su(var)3-1 was identified as "antimorphic" mutants of the euchromatic H3-S10 kinase JIL-1. JIL-1Su(var)3-1 mutants maintain kinase activity and do not detectably impair repressive histone lysine methylation marks. However, analyses with seven different PEV rearrangements demonstrate a general role of JIL-1Su(var)3-1 in controlling heterochromatin compaction and expansion. Our data provide evidence for a dynamic balance between heterochromatin and euchromatin, and define two distinct mechanisms for Su(var) gene function. Whereas the majority of Su(var)s encode inherent components of heterochromatin that can establish repressive chromatin structures [intrinsic Su(var)s], Su(var)3-1 reflects gain-of-function mutants of a euchromatic component that antagonize the expansion of heterochromatic subdomains [acquired Su(var)s].

Keywords:
Su(var)-Gene, Su(var)3-9, HMTase, Histon-Methylierung, Histon-Modifizierung, Positionseffekt-Variegation, Heterochromatin, Epigenetik, Gensilencing, Drosophila

Su(var) genes, Su(var)3-9, HMTase, histone methylation, histone modification, position-effect variegation, Heterochromatin, epigenetic, gene silencing, Drosophila

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Abkürzungsverzeichnis, Inhaltsverzeichnis (i-vi)
1 Einleitung (1-9)
2 Material und Methoden (10-21)
3 Ergebnisse (22-85)
4 Diskussion (86-99)
5 Zusammenfassung (100-101)
A Literaturverzeichnis (102-120)
Publikationsliste (121)