Maria Zhbanko

Functional analysis of the leader peptidases in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 28.02.2006

Abstract
In dieser Arbeit wurde die Funktion der Leaderpeptidasen in dem photosynthetisierenden Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC6803 mittels Inaktivierung der entsprechenden Genen und Analyse der Mutanten untersucht. Es gibt anscheinend eine Aufteilung der Funktionen der beiden Leaderpeptidasen dieses Bakteriums. Die Leaderpeptidase LepB2 ist ein lebenswichtiges Protein für Synechocystis 6803. Leaderpeptidase LepB1 spielt eine wichtige Rolle für die optimale Ausführung der Photosynthese und ist daher für das photoautotrophe Wachstum wichtig. Die Ergebnisse der Untersuchung der lepB1::KmR Mutante deuten daraufhin, dass die Leaderpeptidase LepB1 sich an der Entwicklung der Thylakoidmembran von Synechocystis sp. PCC 6803 beteiligen könnte. Die Assemblierung der photosynthetischen Komplexe in den Mutantenzellen wurde aber in den photomixotrophen Wachstumsbedingungen bei schwachem Licht nicht beeinflusst.
Die Inaktivierung der LepB1 führte zu einer hohen Lichtsensibilität der Synechocystis-zellen. Diese könnte als starke Schädigung der Photosynthesekomplexen im Licht beobachtet werden. Die photosynthetische Aktivität wird in den Zellen der Mutante durch das Licht gehemmt. Diese Eigenschaft ist ein Merkmal der photooxidativen Schädigung, die wahrscheinlich durch den ineffizienten Ersatz der beschädigten Komponenten der Photosynthesemaschinerie verursacht wird. Das könnte aufgrund des Fehlens der Leaderpeptidase entstehen, die Signalpeptide der photosynthetischen Vorläuferproteine entfernt. Proteomische und immunologische Untersuchungen der Mutante haben gezeigt, dass LepB1 an der Prozessierung der photosynthetischen Proteine beteiligt ist. Dies betrifft unter anderen das PsbO Protein, welches die Untereinheit des Wasserspaltungsapparates der PSII ist, und offenbar ein weiteres Protein dieses Komplexes PsbU. Allerdings, die Funktion der LepB1 ist wichtig, aber nicht essentiell für die Reifung dieser Proteine.
Die Versuche mit der Komplementierung haben gezeigt, dass die LepB Leaderpeptidase aus E. coli die Funktion der Peptidase LepB1 ersetzen kann, und so das photoautotrophe Wachstum und die vollständige Prozessierung des PsbO Proteins wiederherstellen. Allerdings war in den photoautotrophen Wachstumsbedingungen der Phänotyp des Komplementierungsstammes nicht identisch mit dem Phänotyp des wilden Typs. Das deutet daraufhin, dass die Funktionen der beiden homologen Proteine nicht absolut identisch sind.

In this work, the function of leader peptidases in the photosynthetic cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 has been studied by inactivation of the respective genes and analysis of the mutants. Apparently, there is a division of function of the two leader peptidases of this cyanobacterium. The leader peptidase LepB2 is an essential protein of Synechocystis 6803. Leader peptidase LepB1 is important for the optimal performance of photosynthesis and therefore for photoautotrophic growth. The results of study of the lepB1::KmR mutant suggest that LepB1 might be involved in the development of the thylakoid membrane system of Synechocystis 6803. However, the assembly of the photosynthetic complexes was not affected in the mutant cells when grown in the presence of glucose under weak light conditions.
The inactivation of the leader peptidase LepB1 lead to a high light sensitivity of Synechocystis 6803 cells, which could be observed as a strong degradation of the photosynthetic complexes in the presence of light. The photosynthetic activity becomes inhibited by light in the mutant cells. These observed features were indicative of photooxidative damage, which was probably caused by inefficient replacement of damaged components of the photosynthetic machinery due to the lack of a leader peptidase removing the signal peptides from photosynthetic precursor proteins. Indeed, the proteomic and immunological studies revealed that LepB1 is involved in processing of photosynthetic proteins, i.e. the PsbO and PsbU. However, the function of LepB1 is important but not essential for the maturation of these proteins.
The complementing experiments have shown that homologous LepB protein from E. coli can functionally substitute LepB1, which restores the photoautotrophic growth and complete PsbO processing. However in photoautotrophic growth conditions the phenotype of the complementing strain is not identical to that of the wild type, suggesting that the functions of homologous proteins are not absolutely identical.

Keywords:
Leaderpeptidase, LepB1, Synechocystis, PsbO, Prozessierung der Proteine, Thylakoidmembran

Leader peptidase, LepB1, Synechocystis, PsbO, protein processing, thylakoid membrane

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Inhaltsverzeichnis
Title page, Table of contents, Abbreviations (1, 1-6)
1. Introduction (7-19)
2. Materials and Methods (20-44)
3. Results (45-94)
4. Discussion (95-102)
5. Summary (103-104)
6. References (105-114)
Appendix (115-128)
Publikation (129)