Susanne Haufe

Untersuchungen zur Struktur und Faltung der Phospholipase D aus Weißkohl

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 12.04.2006

Abstract
Pflanzliche Phospholipasen D (PLD) des α-Typs sind durch ihr breites Substratspektrum eine interessante Alternative für die industrielle Herstellung modifizierter Phospholipide. Trotzdem ist das Wissen über strukturelle Informationen dieser Enzyme bisher sehr begrenzt. Für die in dieser Arbeit untersuchte PLD2 aus Weißkohl konnte mittels Röntgenkleinwinkelstreuung eine Oberflächenstruktur bestimmt werden. Die PLD2 liegt monomer vor und weist eine längliche Molekülform mit lockerer strukturierten apikalen und basalen Bereichen auf. Calciumionen sind für die Aktivität der PLD2 essenziell. Anhand der calciumkonzentrationsbezogenen Aktivitätszunahme sowie einer calciumspezifischen Erhöhung der Molaren Elliptizität im Nah-UV-CD-Spektrum bei 280 nm konnten zwei getrennte Calciumbindungsereignisse identifiziert werden, deren Dissoziationskonstanten bei 0,07 bzw. 0,16 mM und 19,1 bzw. 8,6 mM lagen.
Für die Charakterisierung des Proteins wurden spektroskopische Methoden wie Fluoreszenzund Circular Dichroismus (CD)-Spektroskopie genutzt. Der erste Guanidinhydrochlorid (GdnHCl)- bzw. Harnstoff-induzierte Entfaltungsschritt sowie die Säure- und Temperaturinduzierte Entfaltung führten zu einer teilentfalteten PLD2. Die teilentfaltete PLD2 bindet den hydrophoben Farbstoff 1-Anilino-8-naphtalensulfonat, weist eine nativ-ähnliche Sekundärstruktur auf, zeigte jedoch keine definierte Tertiärstruktur mehr. Dieses Intermediat hatte somit Eigenschaften ähnlich dem molten globule-Zustand. Durch analytische Ultrazentrifugation wurde die teilentfaltete PLD2 jedoch als heterogenes Aggregatgemisch identifiziert, wobei die monomere Spezies nicht gefunden werden konnte. Die Bildung dieser Aggregate begründet die Irreversibilität des ersten Entfaltungsvorgangs, wobei die detektierten strukturellen Änderungen mit einer Enzyminaktivierung einhergingen.
Die Entfaltung der Sekundärstruktur der PLD2 konnte durch Harnstoff und GdnHCl induziert und mittels CD- und Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen werden. Der zweite Übergang der PLD2 verlief kooperativ und reversibel zu einer random coil-ähnlichen Konformation. Da der erste Entfaltungsschritt durch nur minimale Sekundärstrukturänderungen gekennzeichnet war und zudem irreversibel verlief, wurde eine getrennte Domänenentfaltung als Ursache für die zwei Übergänge der Denaturans-induzierten Entfaltung ausgeschlossen. In Verbindung mit Ergebnissen einzelner PLD2-Fragmente wird der erste Übergang so interpretiert, dass insbesondere die spezifischen Domäneninteraktionen zerstört werden, welche sich möglicherweise nur bei co-translationaler Faltung korrekt ausbilden können. Die Verbindung dieser Ergebnisse mit der Aufnahme von kinetischen Faltungs- und Entfaltungskurven ermöglichte die Aufstellung eines Faltungsmodells für die PLD2.

Owing to their broad substrate specificity, plant α-type phospholipases D (PLD) are an interesting alternative for the industrial production of modified phospholipids. Nevertheless, structural information of these enzymes are still restricted. A surface model of the PLD2 from cabbage was deduced from small angle X-ray scattering data. The PLD2 is a monomeric enzyme with a longish shape, looser structered in the apical and basal regions. Calcium ions are essential for activity. The increase in activity and molar ellipticity in the near UV range at 280 nm was specifically dependent on the calcium concentration and revealed two calcium binding events with dissociation constants of 0,07 or 0,16 mM and 19,1 or 8,6 mM, respectively.
Spectroscopic techniques like fluorescence and circular dichroism (CD) spectroscopy were used for the characterization of the protein. The first unfolding step of the guanidine hydrochloride (GdnHCl)- and urea-induced unfolding as well as the temperature and acidinduced unfolding of the enzyme yielded partially unfolded PLD2. This partially unfolded PLD2 bound 1-anilino-naphthalene sulfonate and had a native-like secondary structure but no distinct tertiary structure. Consequently, this intermediate showed porperties similar to the molten globule state. However, using analytical ultracentrifugation, the partially unfolded PLD2 was identified as heterogeneous aggregates. No monomeric species could be detected. The formation of the aggregates explained the irreversibility of the first unfolding step. The detected structural alteration and the enzyme inactivation coincided.
The unfolding of the PLD2 secondary structure was induced by higher concentrations of GdnHCl or urea proofed by CD- and fluorescence spectroscopy. This second unfolding step was highly cooperative and reversible leading to a random coil-like conformation. As the first unfolding step was irreversible and showed only little changes in secondary structure, separate unfolding of domains causing the two unfolding steps of the denaturant-induced unfolding was precluded. In accordance with results of PLD2 enzyme fragments, the first unfolding step is interpreted as the destruction of specific domain interactions whose correct formation possibly needs co-translational folding. A folding scheme could be established which summarizes these results in connection with kinetic folding- and unfolding data.

Keywords:
Phospholipase D, Weißkohl, C2-Domäne, Calcium, Struktur, Faltung, Entfaltung, Aggregation

phospholipase D, cabbage, C2 domain, calcium, structure, folding, unfolding, aggregation

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Symbole und Abkürzungen (1, I-III)
1 Einleitung und Aufgabenstellung (1-2)
2 Theoretischer Teil (3-20)
3 Materialien und Methoden (21-42)
4 Ergebnisse und Diskussion (43-105)
5 Zusammenfassung (106-108)
6 Literaturverzeichnis (109-118)