Maria Henriette Alpermann

Untersuchungen zum Alternativen Terpenbiosyntheseweg in Escherichia coli und Nicotiana benthamiana

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 27.01.2006

Abstract
Für die Terpenbiosynthese gewinnt der Deoxyxylulosephosphat-Biosyntheseweg (DXP-Weg) als alternativer Syntheseweg neben dem länger bekannten Acetat-Mevalonat-Weg an Bedeutung. Dieser Stoffwechselweg kommt sowohl in gramnegativen und einigen grampositiven Bakterien als auch in Pflanzen, nicht jedoch in Säugetieren vor. Daher stellen seine Enzyme und Intermediate ideale Zielstrukturen für innovative Antibiotika, Antimalaria-Mittel und Herbizide dar.
Zur Aufklärung der Biosyntheseschritte des DXP-Weges war die Darstellung von kommerziell nicht verfügbaren Intermediaten erforderlich. Für deren enzymatische Synthese wurden die codierenden Sequenzen der sieben Escherichia coli-Enzyme
     1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphat Synthase (DXS),
     4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol Synthase (IspD),
     4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol Kinase (IspE),
     2C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphat Synthase (IspF),
     2C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphat Reduktase (GcpE),
     1-Hydroxy-2-methylbutenyl 4-diphosphat Reduktase (LytB) und
     D-Xylulokinase (XylB) als 1-Deoxy-D-xylulose phosphorylierendes Enzym kloniert.
Diese Enzyme und die 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphat Reduktoisomerase (DXR) des DXP-Weges konnten durch Proteinexpression mit Hexahistidin-Fusion und Reinigung mit Metall-Chelat-Affinitätschromatographie als aktive und lösliche Proteine im Milligramm-Maßstab dargestellt werden. Durch enzymatische und chemische Synthesen konnten sowohl unmar-kierte als auch 13C- und 14C-Metabolite des DXP-Weges gewonnen werden, beispielsweise [1,2-13C2]1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphat und [1,2-14C2]1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphat.
Bei der Synthese lebensnotwendiger isoprenoider Verbindungen in Bakterien ist die Isopentenyldiphosphat-Dimethylallyldiphosphat-Isomerase (IDP-Isomerase) entbehrlich. In höheren Pflanzen war die Funktion dieses Enzyms noch ungeklärt. Daher wurde aus einer cDNA-Bibliothek die IDP-Isomerase von Cannabis sativa durch Homologie-Klonierung isoliert. Der offene Leserahmen umfasste 810 Nukleotide und codierte ein Protein mit 269 Aminosäuren. Die IDP-Isomerasen aus C. sativa und E. coli wurden mit Polyhistidin-Fusion kloniert. Durch Proteinexpression und Reinigung mit Metall-Chelat-Affinitätschromatographie konnten lösliche Proteine im Milligramm-Maßstab gewonnen werden. Beide rekombinanten IDP-Isomerasen wiesen katalytische Aktivität auf. Die publizierte HPLC-Methode für das Produkt der IDP-Isomerasen wurde im Rahmen dieser Arbeit überprüft.
Die funktionale Untersuchung einer pflanzlichen IDP-Isomerase erfolgte an Nicotiana benthamiana. Durch Virus-vermittelte RNA-Interferenz ("virus induced gene silencing") wurde das für die IDP-Isomerase codierende idi-Gen ausgeschaltet. Makroskopisch, mikroskopisch und in der Pigmentzusammensetzung wiesen diese Pflanzen Veränderungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen auf. Die Ergebnisse zeigten, dass die IDP-Isomerase für eine physiologische Terpenbiosynthese in Pflanzen notwendig ist.
Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zur weiteren Aufklärung einzelner Biosyntheseschritte des DXP-Weges bei. Die Bedeutung der IDP-Isomerase für die Terpenbiosynthese höherer Pflanzen wurde nachgewiesen. Darüber hinaus ergeben sich neue Ansatzpunkte für die Entwicklung von innovativen Pharmazeutika.

The deoxyxylulose phosphate (DXP) pathway gains importance beside the established mevalonate pathway. Gram-negative bacteria, some gram-positive bacteria and plants utilize the DXP pathway, but the pathway is not found in mammals. Hence the enzymes and intermediates are attractive targets for the development of novel antibiotic, antimalarial and herbicidal agents.
The synthesis of commercially not available intermediates was required for investigation of the biosynthetic steps in the DXP pathway. Coding sequences of the seven enzymes from Escherichia coli were cloned for enzyme-assisted synthesis of metabolites:
     1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS),
     4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol synthase (IspD),
     4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol kinase (IspE),
     2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (IspF),
     2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate reduktase (GcpE),
     1-hydroxy-2-methylbutenyl 4-diphosphate reduktase (LytB) and
     D-xylulokinase (XylB) for the phosphorylation of 1-deoxy-D-xylulose.
These enzymes and the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reduktoisomerase (DXR) were expressed with hexahistidin tag and purified by metal affinity chromatography. The soluble enzymes showed catalytic activity and could be synthesised in milligram amounts.
By different enzymatic and chemical syntheses intermediates of the DXP pathway with different isotope-labelling patterns were obtained, e.g. [1,2-14C2]1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate und [1,2-13C2]1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate.
Isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate (IDP) isomerase is a nonessential enzyme for isoprenoid synthesis in bacteria. The function of the enzyme in higher plants remained to be elucidated. IDP isomerase was isolated from a cDNA library of Cannabis sativa by homology cloning. The open reading frame included 810 nucleotides and encoded a protein of 269 amino acids. This enzyme and the IDP isomerase from Escherichia coli were cloned with a hexahistidin tag. Protein expression and purification with metal affinity chromatography led to soluble enzymes in milligram amounts. The recombinant IDP isomerases from C. sativa and E. coli showed catalytic activity. In the context of these investigations the published HPLC-method for detection of enzymatic activity of IDP isomerase was checked.
Functional analysis of plant IDP isomerase was carried out on Nicotiana benthamiana. By virus induced RNA-interference (virus induced gene silencing) the idi-gene coding for IDP isomerase was silenced. Considerable alterations compared to the control plants were detected macroscopically, microscopically and by the composition of pigments. The results demonstrated that the IDP isomerase is required for the physiological biosynthesis of terpenoids in plants.
By these results the DXP pathway has become a bit more distinct, and the importance of the IDP isomerase for terpene biosythesis in higher plants was demonstrated. In addition, new chances for novel lead compounds for pharmaceutical application became evident.

Keywords:
Deoxyxylulosephosphat-Biosyntheseweg, DXP-Weg, Alternativer Terpenbiosyntheseweg, Isoprenoid-Biosynthese, Terpene, Enzyme, Synthese, HPLC, Isopentenyldiphosphat-Dimethylallyldiphosphat-Isomerase, IDP-Isomerase, VIGS

deoxyxylulose phosphate pathway, DXP pathway, non-mevalonate pathway, isoprenoid biosynthesis, terpene, enzymes, synthesis, HPLC, isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase, IDP isomerase, VIGS

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1, I-VI)
1 Einleitung (1-20)
2 Material und Methoden (21-43)
3 Ergebnisse (44-99)
4 Diskussion (100-123)
5 Zusammenfassung (124-126)
6 Literaturverzeichnis (127-140)
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