Alexander Anders

Molekularer Mechanismus eines Transkriptionsschalters: Experimentelle Analyse und mathematische Modellierung des Gal4-Gal80-Gal1-Regulationsmoduls aus Kluyveromyces lactis

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 10.05.2006

Abstract
Der Galaktose-Schalter der Hefe Kluyveromyces lactis besteht aus drei regulatorischen Proteinen, dem Transkriptionsaktivator KlGal4, dessen Inhibitor KlGal80 und dem Protein KlGal1, welches den Galaktose-Sensor darstellt. Thema dieser Arbeit sind Untersuchungen zum molekularen Mechanismus des Schalters.
Durch analytische Gelfiltration und analytische Ultrazentrifugation wird hier gezeigt, dass KlGal80 die Fähigkeit zur Multimerisierung besitzt. Eindeutig konnte eine dimere Form nachgewiesen werden; bei einer unter gewissen Bedingungen auftretenden multimeren Form höherer Ordnung handelt es sich wahrscheinlich um ein KlGal80-Tetramer.
Es war bekannt, dass KlGal80 im Zellkern lokalisiert ist, KlGal1 hingegen sowohl cytoplasmatisch als auch nukleär. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wird in dieser Arbeit nachgewiesen, dass die Interaktion zwischen beiden Proteinen in K. lactis im Zellkern stattfindet.
Es wird gezeigt, dass die Bindung zwischen KlGal1 und KlGal80 in einer Inhibierung der enzymatischen Galaktokinase-Aktivität von KlGal1 resultiert. Auf der Basis dieses Inhibierungsexperimentes konnte die Stärke der Interaktion zwischen KlGal1 und verschiedenen KlGal80-Varianten ermittelt werden. Zudem wird nachgewiesen, dass die Aktivierungsdomäne (AD) von Gal4 zur Aufhebung der Inhibierung führt. Dies zeigt, dass die AD und KlGal1 um die Bindung an KlGal80 konkurrieren und legt den Schluss nahe, dass der Galaktose-Schalter in vivo auf der Basis eines kompetitiven Mechanismus operiert. Die Quantifizierung der Gal4-KlGal80-Interaktion offenbart, dass die apparente Affinität der KlGal80-Gal4-Interaktion wesentlich höher ist als die der KlGal80-KlGal1-Interaktion.
Auf der Basis der experimentellen Daten wurde ein mathematisches Modell zur Beschreibung der Interaktionen zwischen den Regulatoren des Galaktose-Schalters aus K. lactis erstellt. Durch Simulationen wird gezeigt, dass ein Schalter trotz der im Vergleich zur Gal4-Gal80-Affinität sehr niedrigen Gal1-Gal80-Affinität effizient operieren kann. Eine wichtige Voraussetzung hierfür ist ein Interaktionsmodus zwischen Gal1 und Gal80, nach welchem zwei monomere Gal1-Moleküle an dimeres Gal80 binden können. In Übereinstimmung mit diesem Interaktionsmodus wird mittels analytischer Ultrazentrifugation die Formation eines heterotetrameren KlGal1-KlGal80-Komplexes mit einer Stöchiometrie von 2:2 nachgewiesen.

The galactose transcription switch of the yeast Kluyveromyces lactis consists of three regulatory proteins, the transcriptional activator KlGal4, its inhibitor KlGal80 and the galactose sensing protein KlGal1. Here, the molecular mechanism of the switch is investigated.
Analytical gelfiltration and ultracentrifugation experiments reveal that KlGal80 is able to multimerise. Clearly, the formation of a dimer can be demonstrated. Under certain conditions a form presumably representing a tetramer is detectable.
KlGal80 has been reported to be a nuclear protein whereas KlGal1 located throughout the cell. In accordance with these results, it is shown here that the interaction between both proteins occurs in the nucleus.
By means of an enzymatic assay it is demonstrated that binding between KlGal80 and KlGal1 results in inhibition of the KlGal1 galactokinase activity. On the basis of this inhibition experiment the affinity between KlGal1 and different KlGal80 variants could be determined. Furthermore it is shown that the transcription activation domain (AD) of KlGal4 abrogates KlGal1 inhibition indicating a competition between KlGal1 and the AD for binding to KlGal80. These results suggest that the galactose switch operates on the basis of a competitive mechanism. Quantitation of the KlGal80-Gal4 interaction reveals a much higher apparent affinity of KlGal80 for Gal4 as compared to KlGal1.
On the basis of the results presented here, a mathematical model describing the interactions between the regulators of the galactose switch was developed. It is shown that a switch based on competition between Gal1 and Gal4 for Gal80 binding could operate efficiently despite the much lower affinity of KlGal80 for KlGal1 as compared to Gal4. However, an important assumption allowing for efficient switching is an interaction mode between the regulators, according to which two monomeric Gal1 molecules can bind to dimeric Gal80. Consistent with such a mechanism, analysis of the sedimentation behaviour by analytical ultracentrifugation demonstrates the formation of a heterotetrameric KlGal80-KlGal1 complex of 2:2 stoichiometry.

Keywords:
Transkription, Schalter, Regulation, Gal4, Gal80, Gal1, Protein-Protein-Interaktion, Galaktose, GAL-Regulon, Affinität

transcription, switch, regulation, Gal4, Gal80, Gal1, protein-protein interaction, galactose, GAL regulon, affinity

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung (1-13)
2. Material und Methoden (14-27)
3. Ergebnisse (28-87)
4. Diskussion (88-108)
5. Zusammenfassung (109-110)
6. Literaturverzeichnis (111-121)
7. Abkürzungsverzeichnis