Kati Erdmann

Antioxidative Wirkungen von schwefelhaltigen Aminosäuren und bioaktiven Peptiden: Hämoxygenase-1 und Ferritin als Mediatoren

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 16.10.2006

Abstract
Verschiedenen Nahrungsbestandteilen wie z.B. biologisch aktiven Peptiden oder Aminosäuren wird neben der nutritiven Bedeutung zunehmend eine funktionelle Relevanz bei der Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen wie Atherosklerose, Herzinfarkt oder Schlaganfall zugesprochen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Enzyme Hämoxygenase-1 (HO-1) und Ferritin als Vermittler endothelprotektiver und antioxidativer Effekte von schwefelhaltigen Aminosäuren und von Oligopeptiden mit ACE-inhibitorischen Eigenschaften untersucht. In humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene induzierten die schwefelhaltigen Aminosäuren L-Methionin, L-Cystein und S-Adenosylmethionin (SAM) sowie das ACE-inhibitorische Dipeptid Methionyl-Tyrosin (Met-Tyr) die HO-1 auf Proteinebene sowohl konzentrations- als auch zeitabhängig. Die freien Aminosäuren L-Methionin und L-Tyrosin ließen unter den gewählten Bedingungen (mikromolarer Konzentrationsbereich) ebenso wie andere ACE-inhibitorische Substanzen (Captopril, Methionyl-Phenylalanin) und Methionin-haltige Dipeptide (Methionyl-Methionin) die Proteinexpression der HO-1 unbeeinflusst. Die Induktion der HO-1 durch L-Methionin und L-Cystein war auch auf Ebene der katalytischen Aktivität messbar. L-Cystein und SAM waren außerdem in der Lage, die Transkription des HO-1-Gens ebenfalls konzentrations- und zeitabhängig zu stimulieren. Diese beiden Substanzen regulierten die HO-1-Genexpression auf transkriptioneller Ebene über eine Erhöhung der Promotoraktivität. L-Methionin und Met-Tyr bewirkten keine Induktion der HO-1-mRNA. Jedoch konnte für beide Substanzen eine Stabilisierung der HO-1-mRNA nachgewiesen werden. Darüber hinaus führten L-Methionin, L-Cystein und Met-Tyr zu einer konzentrations- und zeitabhängigen Steigerung der Ferritinproteinsynthese. Funktionelle Konsequenzen der beobachteten genomischen Effekte wurden in einem Zellkulturmodell für oxidativen Stress untersucht. L-Methionin, SAM und Met-Tyr zeigten indirekte antioxidative Wirkungen. Der radikalfangende Effekt von Met-Tyr trat unabhängig von dessen ACE-inhibitorischer Wirkung auf und war für dieses Dipeptid spezifisch. Im gleichen Modell bewirkte der HO-1-Metabolit Bilirubin konzentrations-abhängige antioxidative Effekte. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass HO-1-Metaboliten unter den gewählten Bedingungen als Mediatoren der getesteten Substanzen fungieren können. Mit Hilfe des HO-Inhibitors Zink-Bisglykolporphyrin konnte ein kausaler Zusammenhang zwischen der HO-1-Induktion durch L-Methionin, SAM und Met-Tyr und deren indirekten antioxidativen Wirkungen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass verschiedene schwefelhaltige Aminosäuren und das ACE-inhibitorische Dipeptid Met-Tyr potente Aktivatoren antioxidativer und antiinflammatorischer Stoffwechselwege sind. Dieser neuartige Wirkmechanismus lässt auf ein antiatherogenes Potenzial der untersuchten Nahrungsbestandteile schließen und unterstreicht die Bedeutung diätetischer Maßnahmen bei der Prävention der Atherosklerose und anderer inflammatorischer Prozesse.

Emerging evidence suggests an important role of nutritional factors (e.g. biological active peptides or amino acids) in prevention of cardiovascular diseases such as atherosclerosis, heart attack or stroke. The present study investigates the involvement of heme oxygenase-1 (HO-1) and ferritin in mediating cytoprotective and antioxidant actions of sulphur-containing amino acids and ACE-inhibitory oligopeptides. Incubation of human endothelial cells with L-methionine, L-cysteine, S-adenosylmethionine (SAM) and the ACE-inhibitory dipeptide methionine-tyrosine (Met-Tyr) led to an increased expression of HO-1 protein in a concentration- and time-dependent fashion. In contrast, the single amino acids L-methionine and L-tyrosine at micromolar concentrations as well as other ACE-inhibitory agents (captopril, methionine-phenylalanine) or methionine-containing dipeptides (methionine-methionine) left HO-1 protein expression unaltered. L-Methionine- and L-cysteine-induced HO-1 protein expression was accompanied by an increased catalytic activity of the enzyme. L-Cysteine and SAM significantly elevated HO-1 mRNA levels in a concentration- and time-dependent manner. HO-1 gene expression was regulated at the level of transcription via increased promoter activity. L-Methionine and Met-Tyr did not influence HO-1 mRNA expression directly. However, there is strong evidence that these substances stabilize HO-1 mRNA. Treatment of endothelial cells with L-methionine or Met-Tyr markedly prolonged the half-life of HO-1 mRNA after exposure to the potent HO-1 inducer CdCl2. Furthermore, L-methionine, L-cysteine and Met-Tyr produced increases in ferritin protein expression. L-Methionine, SAM and Met-Tyr reduced NADPH-dependent production of oxygen radicals at concentrations that were also effective in HO-1 induction. This effect was observed only after several hours of pretreatment and sustained after washing out either agent, pointing to an indirect antioxidant action of the tested substances rather than direct radical scavenging. The cytoprotective action of Met-Tyr occurred independently of its ACE-inhibitory properties and was specific for this dipeptide. The role of HO-1 as a mediator of antioxidant activities of the tested substances under these conditions was demonstrated by the direct radical scavenging effect of the HO-1 product bilirubin. In agreement with this, endothelial cell protection by L-methionine, SAM and Met-Tyr was abrogated in the presence of the HO-inhibitor zinc deuteroporphyrin IX 2,4-bis-ethylene glycol, suggesting that HO-1 and its enzymatic products are indeed of functional relevance and responsible for the observed antioxidant actions. These findings demonstrate that several sulphur-containing amino acids and the ACE-inhibitory dipeptide Met-Tyr are potent activators of antioxidant and anti-inflammatory pathways. This novel, potentially antiatherogenic mechanism of the tested nutritional factors underlines the importance of dietary measures in prevention of atherosclerosis and other inflammatory processes.

Keywords:
ACE-Inhibitoren, antioxidativ, Atherosklerose, bioaktive Peptide, Endothelzellen, Ferritin, Hämoxygenase-1, Methioninstoffwechsel, oxidativer Stress, schwefelhaltige Aminosäuren

ACE-inhibitors, antioxidant, atherosclerosis, bioactive peptides, endothelial cells, ferritin, heme oxygenase-1, methionine metabolism, oxidant stress, sulphur-containing amino acids

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1, 1-5)
1 Einleitung (6-21)
2 Problemstellung (22-23)
3 Material und Methoden (24-36)
4 Ergebnisse (37-74)
5 Diskussion (75-85)
6 Zusammenfassung (86-87)
7 Literaturverzeichnis (88-104)
8 Veröffentlichungen (105-106)