Fikru Belema Bedada

Plasticity of Murine Bone Marrow-Derived Adult Stem Cells: acquisition of specialized properties and contribution to embryonic development

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 01.11.2006

Abstract
Obwohl es in den letzten Jahren Enthusiasmus über die Möglichkeiten gab, daß adulte Stammzellen aus Säugetieren fähig sein können, über ihre Abstammungsgrenzen hinaus zu differenzieren, so sind solche Stammzellen noch nicht vollständig charakterisiert worden. Im Besonderen ist das Potential zur Transdifferenzierung durch Behandeln definierter Zellen mit verschiedenen Stimuli nicht vollständig erforscht worden. Im Rahmen dieser Studie isolierte ich zwei sich selbst langzeitig erneuernde Populationen von Mäusestammzellen und nannte sie BM-MASCS1 und mBM-MASCs2. Ich charakterisierte ihre multipotenten Differenzierungsreaktionen auf verschiedene bioaktive Moleküle in vitro und ihren Beitrag zur Entwicklung von schimären Embryonen in vivo. Die durchflußzytometrische Charakterisierung zeigte, daß beide Zellpopulationen sich in ihrer CD34 und Sca-1 Expressionsstärke unterscheiden, aber in Bezug auf andere Oberflächenmarker tatsächlich nicht unterscheidbar sind. Zusätzlich exprimieren sie verschiedene pluripotente oder für Stammzellen charakteristische Gene wie Oct3/4, nanog, SSEA-1 Rex-1 und B-myb, alle typisch für undifferenzierte ES Zellen.
Die Inkubation mit verschiedenen Stimuli wie die wnt7a, wnt7b, wnt4, wnt11, CA-LEF und CDO oder epigenetisches Reprogrammieren mit 5-Azazytidine oder TSA (einzeln und in Kombination) induzierten die Expression von myogenen Markern wie Myf5, MyoD, Pax7, Myogenin und MRF4. Mehrere Strukturproteine wie sarkomerisches MyHC und TnI wurden auch immunhistochemisch nachgewiesen. Weiterhin induzierten unterschiedliche wnts und CA-LEF nicht nur das Muskelprogramm sondern translozierten ß-Catenin in den Nukleus von mBM-MASCS, auf die Notwendigkeit von β-Catenin für das myogene Programm hindeutend. Die Differenzierung der myogenen Linien wurde auch durch die Infektion von mBM-MASCs mit einem Myogenin-eGFP enthaltendem lentiviralen Reporterkonstrukt untersucht, durch Induktion mit wnt7A und durch die Expansion über FACS sortierte positive Zellen. Die Mehrheit dieser sortierten Zellen war für das sarkomerische MyHC (MF-20) positiv und fusionierte prompt mit der bona fide Muskelzelllinie C2C12, wenn sie in Differenzierungsmedium gehalten wurden.
Interessanterweise führte die Behandlung mit wnt7a, wnt7b, wnt4 und CA-LEF nicht zur Expression von Kardiomyozytenmarkern wie α-MHC, myocardin A, β-MHC, ANP und BNP, während die Behandlung mit wnt11 zur Expression von Nkx-2.5, Myocardin A, GATA-4, β-MHC und BNP führte. Die Zugabe von PKC Inhibitoren verzögerte die Wirkung von wnt-11, was sich durch den Verlust der Expression der Mehrheit der kardiomyozytenspezifischen Gene manifestierte, die in der Initiation genauso wie in der Progression der Differenzierung involviert sind und die Notwendigkeit eines vom PKC-Pathway abhängigen wnt11 "Signalling" wahrscheinlich machen. Epigenetisches Reprogrammieren mit 5-Azazytidine, TSA oder beidem, induzierte zusätzlich die Expression von α-MHC, was durch RT-PCR und α-MHC-eGFP Reportergenexpression demonstriert wurde. Die Behandlung von mBM-MASCs mit 5-Azacytidine oder BMP-2 trug auch zur Expression der basischen Phosphatase (ALP) bei, einem charakteristischen Marker der Osteozyten.
Bei beiden adulten Stamzellpopulationen wurde auch immunhistochemisch nach FGF-2 Behandlung die Expression der neuronalen Marker DBH und TH durch RT-PCR und βIII-tubulin, neurofilament NF-200, GFAP und Nkx5.1-LacZ reporter gene gezeigt. Zusätzlich induzierte "Hepatocyte Growth Factor" die Expression von Albumin und SEK-1 und eine epitheloidähnliche Morphologie. Letztendlich trugen genetisch markierte mBM-MASCs zur Entwicklung der Somiten, des Herzens und des Endotheliums in schimären Embryonen bei.
Zusammengefaßt zeigen diese Daten, daß die zwei isolierten mesenchymalen Stammzellpopulationen die Fähigkeit besitzen, mehrere Aspekte von mesodermalen, neuroektodermalen und endodermalen Linien in vitro zu erlangen und zur Entwicklung von schimären Embryonen in vivo beitragen.

Although we have seen much excitement in recent years about the possibility that adult mammalian stem cells may be able to differentiate across lineage boundaries, such stem cells have not been fully characterized. In particular, the potential for trans-differentiation has not been assessed comprehensively by subjecting characterized cells to various stimuli. In the course of this study, I have isolated two long term self-renewing murine adult stem cell populations termed mBM-MASCs1 and mBM-MASCs2 and characterized their multi-lineage differentiation responses to various bioactive molecules in vitro as well as their contribution to the development of chimeric embryos in vivo. FACS characterization revealed that both cell populations differ in their CD34 and Sca-1 expression levels but are virtually indistinguishable with respect to other surface markers. In addition, they express various pluripotency or stemness genes such as Oct3/4, Nanog, SSEA-1, Rex-1 and B-Myb typical for undifferentiated ES cells.
Treatment with various stimuli including wnt7a, wnt7b, wnt4, wnt11 CA-LEF and CDO or epigenetic reprogramming with 5-azacytidine or TSA or both induced expression of myogenic markers such as Myf5, MyoD, Pax7, Myogenin, and MRF4. Several structural proteins like sarcomeric MyHC and TnI were also detected by immunohistochemistry. Furthermore, distinct wnts and CA-LEF not only induced muscle programme but also localized β-catenin within the nucleus of mBM-MASCs, suggesting the requirement of β-catenin for the myogenic programme. Differentiation of myogenic lineages were also monitored by infection of mBM-MASCs with myogenin-eGFP containing lentivirus reporter construct, induction with Wnt 7A and expansion of FACS sorted GFP positive cells. The majority of these sorted cells became positive for sarcomeric MyHC (MF-20) and also fused readily with the bona fide muscle cell line C2C12 when kept in differentiation medium.
Interestingly, treatment with wnt7a, wnt7b, wnt4 and CA-LEF did not produce expression of cardiomyocyte markers such as α-MHC, myocardin A, β-MHC, ANP and BNP while, treatment with wnt11 led to the expression of Nkx2-5, myocardin A, GATA-4, β-MHC and BNP. Addition of PKC inhibitors attenuated the effect of wnt-11 as manifested by the abrogation of expression of the majority of cardiomyocyte specific genes involved in the initiation as well as progression of differentiation, suggesting the requirement of PKC dependent pathway in wnt11 signalling. Epigenetic reprogramming with 5-azacytidine, TSA or both additionally induced the expression of α-MHC as demonstrated by RT-PCR and α-MHC-eGFP reporter gene expression. Progressive erythroid and myeloid differentiation of mBM-MASCs was monitored by Ter119 and CD45 up-regulation after interleukine-3 treatment using FACS which showed a 2-fold increase compared to basal levels, arguing for a specific induction by IL-3. 5-azacytidine or BMP-2 treatments of mBM-MASCs also contributed to the expression of alkaline phosphatase (ALP), a characteristic marker of osteocytes.
Both adult murine stem cell populations were also shown to express the neuronal markers DBH and TH by RT-PCR and βIII-tubulin, neurofilament, GFAP by immunohistochemistry and Nkx5.1-LacZ reporter gene after FGF-2 treatment. In addition, hepatocyte growth factor treatment induced albumin and SEK-1 expression and an acquisition of epitheloid-like morphology. Finally, genetically labelled mBM-MASCs contributed to the development of somites, heart and endothelium in chimeric embryos. Taken together, these data demonstrate that the two isolated murine mesenchymal stem cell populations have the competence to recapitulate several aspects of the mesodermal, neuroectodermal and endodermal lineage in vitro and contribute to the development of chimeric embryos in vivo.

Keywords:
mBM-MASCs, Mesenchymale Stammzellen, Wnt Signal Proteine, Zellfusion, Mesoderm Zelldifferenzierung, Chimäre Embryone, Ektoderm, Epigenetisches neuprogrammieren, Hybrid Muskelzelle

mBM-MASCs, Mesenchymal stem cells, Wnt signalling Proteins, Cell Fusion, Cell Differentiation, Chimeric Embryo, Mesoderm, Ectoderm, Epigenetic reprogramming, Hybrid Myotube

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Inhaltsverzeichnis
Front page, Contents (1-4)
1 Summary (5-6)
2 Introduction (7-33)
3 Objectives of the study (34-35)
4 Results (36-63)
5 Discussion (64-76)
6 Conclusions (77-78)
7 Materials and methods (79-102)
8 Abbreviations (103-106)
Publications and presentation
Zusammenfassung
Reference List