Christian-Robert Fiedler

Molekulargenetische Analyse neuer Suppressormutanten für Transcriptional Gene Silencing in Arabidopsis thaliana

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 19.01.2007

Abstract
Transkriptional gene silencing (TGS) kontrolliert die Expression repetitiver und homologer Sequenzen durch Cytosin-Methylierung, Histon H3-Methylierung und Chromatin-Modifikation. In TGS-Suppressormutanten wie ddm1, met1 und cmt3 sind DNA-Methylierung, Chromatinanordnung sowie Gen-, Transgen- und Transposonaktivität verändert. Aber nicht alle TGS-Modifikatoren wirken in gleicher Weise. Zunehmend werden neue TGS-Komponenten wie MOM1, BRU1, FAS1, FAS2 and RPA2 beschrieben, die keinen Einfluß auf DNA-Methylierung ausüben.
Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer TGS-Suppressormutanten in Arabidopsis thaliana. Zu diesem Zweck wurde ein neues Testsystem für transcriptional gene silencing zur Mutantenselektion verwendet. Dieses System enthält ein transgenes Konstrukt aus vier hintereinander arrangierten LUCIFERASE-Copien zur Inaktivierung von LUCIFERASE und erlaubt nach EMS-Mutagenese die Visualisierung der TGS-Suppression durch LUCIFERASE-Aktivität.
Mit diesem Testsystem war es möglich 9 TGS-Suppressormutanten mit signifikanter LUCIFERASE-Reaktivierung zu charakterisieren. Sieben Mutanten zeigten Defekte in DDM1, MET1 oder CMT3. Dabei konnte hier zum ersten Mal eine dominant negative ddm1 Mutante beschrieben werden.
Zwei weitere Mutanten zeigten eine signifikante LUCIFERASE-Reaktivierung ohne Beeinträchtigung der DNA-Methylierung. Dabei konnte ebenfalls zu erstem Mal in Arabidopsis thaliana die große Untereinheit der RIBONUKLEOTID-REDUKTASE (RNR1) mit transcriptional gene silencing in Verbindung gebracht werden. Interessanter Weise verbindet RNR1 ebenso wie BRU1, FAS1, FAS2 und RPA2 TGS mit DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Chromatinanordnung. Die zweite TGS-Suppressormutante, die keinen Verlust der DNA-Methylierung aufweist konnte nicht abschließend analysiert werden, da sich der Mutationsort in der perizentrischen Region auf Chromosom 5 befindet.

Transcriptional gene silencing controls the expression of repetitive and homologous sequences by cytosine methylation, histone H3 methylation and chromatin modification. TGS suppressor mutants like ddm1, met1 and cmt3 impaired DNA methylation, chromatin assembly and the activity of endogenous genes, transgenes and transposons. But not all modifiers of transcriptional gene silencing affect the same targets. Increasingly there are novel TGS components like MOM1, BRU1, FAS1, FAS2 and RPA2 that are dispensable for DNA methylation.
This work aimed at the identification and characterization of new TGS-deficient mutants in Arabidopsis thaliana. For this purpose a new experimental system for analysis transcriptional gene silencing was used for mutant isolation. This system contains a transgenic construct of four in series arranged LUCIFERASE copies for inducing LUCIFERASE silencing and allows the visualization of TGS inhibition after EMS mutagenesis by LUCIFERASE activity.
With the help of this system 9 TGS suppressor mutants with significant reactivation of LUCIFERASE silencing could be characterized. Seven mutants showed defects in DDM1, MET1 or CMT3. Here, for the first time, a dominant negative ddm1 mutant could be described.
Two further mutants showed significant reactivation of LUCIFERASE silencing in a DNA-methylation-independent manner. For the first time in Arabidopsis thaliana the large subunit of the RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE (RNR1) could be connected with transcriptional gene silencing. Interestingly, like BRU1, FAS1, FAS2 and RPA2, RNR1 connects the TGS machinery with DNA replication, repair and chromatin assembly. For the second TGS-deficient mutant independent for DNA methylation a successful analyse could not be concluded due to the genomic localization of the mutation in the pericentric region of chromosome 5.

Keywords:
Arabidopsis thaliana, TGS, LUCIFERASE, DNA-Methylierung, MET1, DDM1, CMT3, RNR1

Arabidopsis thaliana, TGS, LUCIFERASE, DNA methylation, MET1, DDM1, CMT3, RNR1

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung (1-12)
2 Material und Methoden (13-24)
3 Ergebnisse (25-50)
4 Diskussion (51-76)
5 Zusammenfassung (77)
6 Literaturverzeichnis (78-93)
7 Anhang (94-100)