Jana Felbel

Untersuchungen zur Miniaturisierung der Polymerase Kettenreaktion (PCR) auf der Basis von Mikrochip-Thermocyclern

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 30.03.07

Abstract
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Mikrochip-Thermocyclern für die Miniaturisierung der Polymerase Kettenreaktion (PCR). Es wurden zwei verschiedene Strategien, die stationäre Chip-PCR und die Durchfluss-PCR realisiert, auf ihre Funktionalität getestet und ihr Einsatzbereich ermittelt. Die Ergebnisse wurden den konventionellen Tischthermocycler-Systemen gegenüber gestellt und Schlussfolgerungen für mögliche Weiterentwicklungen gezogen.
Die Grundlage für die Entwicklung der Chipthermocycler stellten die Untersuchungen über die PCR-Kompatibilität der verwendeten Chipoberflächen und der daran abgeleiteten Oberflächenmodifikationen.
Auf dem entwickelten stationären Chipthermocycler wurden ein PCR-System etabliert, welches in der medizinischen Diagnostik Anwendung findet. Für dieses PCR-System wurden die optimalen Reaktionsbedingungen für die Chip-PCR, sowie deren Nachweisgrenzen ermittelt. Zusätzlich erfolgte der Aufbau und die Etablierung einer Chip-basierten Realtime-Detektion für die Durchführung von Analysen mit hohen Arbeitsgeschwindigkeiten bei geringem Probenbedarf.
Für die Durchfluss-PCR wurde auf der Grundlage eines Glas-Silizium-Chipthermocyclers ein PCR-/RT-PCR System etabliert und aufgrund der ermittelten Reaktionsparameter (Nachweisgrenzen, Fluidikmanagement) ein erweitertes Glas-Glas-Durchfluss-Chipmodul entwickelt. Mit diesem wurden Untersuchungen in verschiedenen Flussregimen durchgeführt und die optimalen Reaktionsbedingungen angepasst auf die veränderten Chipverhältnisse ermittelt.
Die gewonnen Ergebnisse zeigen, dass sich sowohl das entwickelte stationäre als auch das Durchfluss-Chipsystem für Durchführung von PCR/RT-PCR-Methoden in der medizinischen Diagnostik eignen. Die stationären Chipsysteme eignen sich besonders für die schnelle, mobile Vor-Ort-Analytik zur Analyse kleiner Probenzahlen mit geringen Probenvolumen. Während die Durchfluss-PCR-Chipsysteme bei Fragestellungen mit hohen Probendurchsatz und Probenvolumen bis unter 100 nl Anwendung finden.

The aim of this work was the development and the establishment of micro chip thermocycler for miniaturisation of the polymerase chain reaction (PCR). This was realised in two micro chip strategies, the stationary chip PCR and the flow-through PCR. It was shown that both systems have advantages over conventional PCR devices. The application field of these chip systems was investigated. The results were compared with conventional thermocycler and conclusions for further development of micro chip systems were drawn.
The basis for the development of chip thermocycler were the investigations of the PCR compatibility of used chip surfaces and the surface modifications.
A PCR-System for medical diagnostic was established on the stationary chip thermocycler. For this PCR system the optimal reaction conditions and the limit of detection for chip based PCR were determined. Additionally a chip with real time detection was constructed and established, for the performance of analysis with high working speed and low sample requirements.
On the basis of a glass-silicon chip thermocycler a PCR-/RT-PCR system for flow-through PCR reactions was established. Because of the required reaction parameters (limit of detection, flow rate) a new glass-glass flow-through chip module was developed. With that PCR reactions in different flow regimes were accomplished and the optimal reaction conditions were determined.
The extracted results show, that the developed stationary and flow-through chip systems are appropriated to perform PCR/RT-PCR reactions for medical diagnostics.
The stationary chip system is especially suited for transportable point of care solutions with small sample volumes, low number of samples, and high speed analysis. While the flow-through chip system can be used for high throughput analysis with sample volumes smaller than 100 nl.

Keywords:
Polymerase Kettenreaktion, PCR, RT-PCR, Chip-PCR, Lab on Chip, Durchfluss-PCR Mikrochip-Thermocycler, Realtime-Detektion, Vor-Ort-Analytik, Mikrofluidik

Polymerase chain reaction, PCR, RT-PCR, Chip-PCR, Lab on Chip, Flow-through PCR Micro chip thermocycler, Real time detection, Point of care, Micro fluidic

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung (1-13)
2 Materialien und Methoden (14-41)
3 Ergebnisse (42-78)
4 Diskussion (79-95)
5 Zusammenfassung (96-97)
6 Ausblick (98)
7 Literatur (99-104)
8 Anhang (105-114)
Abkürzungen (115-116)