Katrin Heinitz

Untersuchungen zur Toxizität niedermolekularer Aggregationsformen von β-Amyloid auf cholinerge Neuronen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 25.07.2007

Abstract
Ein frühzeitig-auftretendes Merkmal der Alzheimer-Erkrankung ist die progressive Neurodegeneration des cholinergen Transmittersystems, die mit den kognitiven Defiziten der Patienten korreliert. Als mögliche Ursache für den Neuronenverlust wurde die verstärkte Akkumulation von fibrillären β-Amyloid-Peptiden (Aβ) in so genannte senilen Plaques im Hirn diskutiert. Plaques treten jedoch erst in späteren Erkrankungsstadien auf, so dass eine geringe Korrelation zwischen cholinerger Degeneration und Plaquebildung besteht. Neuere Untersuchungen beschäftigen sich verstärkt mit präfibrillären Aggregationsformen von Aβ und ihrer Beeinflussung der neuronalen Integrität.
In der vorliegenden Dissertation wurde der Einfluss zweier verschiedener Aggregationsformen von Aβ(1-42) - frisches Aβ(1-42) und gealtertes Aβ(1-42) - auf die Viabilität der Neuroblastom-Zelllinie SN56.B5.G4 untersucht. Frisches Aβ(1-42), was vorwiegend aus niedermolekularen Aggregationsformen zusammengesetzt war, verursachte in den SN56.B5.G4-Zellen eine konzentrations- und zeitabhängige Zytotoxizität. Fibrillenreiches gealtertes Aβ(1-42) war dagegen untoxisch. Die neurotoxischen Effekte von Aβ(1-42) sind abhängig vom Aggregationszustand des Peptids.
Es konnte gezeigt werden, dass die niedermolekularen Aggregationsformen zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und Apoptose in den cholinergen Zellen führen. Inwieweit sich die Toxizität der niedermolekularen Aβ(1-42)-Aggregationsformen von oxidativem Stress unterscheidet, wurde in einer Genexpressionsstudie mit Hilfe der Microarray-Technologie und quantitativer real-time RT-PCR untersucht. Die Analyse ergab, dass niedermolekulares Aβ(1-42) und oxidativer Stress zu einem unterschiedlichen Expressionsmuster führen. Das oxidative Potenzial des frischen Aβ(1-42) ist vermutlich nicht die einzige Ursache für dessen Toxizität.
Aβ(1-42) verändert die Expression von Apoptose- und Stress-regulierenden Genen, (MAPK-, Bcl-2-Gene). Das Peptid führt zur Abregulation von zahlreichen Genen, die im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und/oder Golgiapparat lokalisiert sind oder Funktionen bei der Proteinsynthese oder Proteinmodifikationen besitzen. Die Befunde lassen auf eine Abschwächung von Abwehrmechanismen gegen Stress im ER durch Aβ(1-42) schließen. Weiterhin beeinflusst Aβ(1-42) Gene, die im direkten Zusammenhang mit der Alzheimer-Pathogenese stehen, wie Komponenten des cholinergen Systems (vesikulärer Acetylcholintransporter), des Lipid- (Apolipoprotein J) und des Zinkstoffwechsels (Zinktransporter). Anhand dieser Gene wird die Anwendbarkeit des Zellmodells zur Simulation pathologischer Prozesse von Morbus Alzheimer demonstriert. Einige Änderungen konnten auch auf Proteinebene mit Western-Blotting/Immunodetektion bestätigt werden.
Die Ergebnisse der Arbeit unterstützen die neueren Untersuchungen, in der die niedermolekularen Aggregationsformen von Aβ(1-42) für die cholinerge Neurodegeneration verantwortlich gemacht werden. Die niedermolekularen Formen sind neurotoxisch, fördern Apoptose und (ER)Stress in den Zellen, was einen frühzeitigen Untergang der cholinergen Neuronenpopulation verursachen könnte, der schon weit vor der Anreichung der Aβ-Peptide in Plaques beobachtet werden kann.

Cholinergic dysfunction is an early-onset feature of Alzheimer’s disease (AD), which has been suggested to cause, at least partly, the cognitive deficits observed. The accumulation of fibrillar β-Amyloid-peptides (Aβ) in senile plaques in the AD brain have been discussed to cause the specific degeneration of cholinergic cells. However, senile plaques are observed in later stages of AD, so a weak correlation between cholinergic degeneration and plaque formation exists. Recent studies provide evidence that also pre-aggregated forms of Aβ play a major role in mediating neurotoxicity.
Using the neuroblastoma cell line SN56.B5.G4, the effect of different Aβ(1-42) aggregates on cell viability was investigated. The cell line expresses typical cholinergic characteristics and thus should represent an appropriate model for cholinergic neurons. Fresh Aβ(1-42), which contained predominantly low-molecular weight species, induced a concentration- and time-dependent toxicity in cholinergic cells. Aged Aβ(1-42), which was rich in fibrils showed no toxic effect, indicating that the neurotoxic effect of Aβ (1-42) depends on the aggregation stage of the peptide.
It was shown that the low-molecular weight species induced apoptosis in cholinergic cells. Furthermore, fresh Aβ(1-42) generated oxidative stress by formation of reactive oxygen species in the cell line.
To determine whether the neurotoxicity of fresh Aβ(1-42) differed from toxicity caused by oxidative stress on cholinergic neurons, a gene expression analyses using microarray technology was performed. The data evaluation showed that Aβ(1-42) and oxidative stress resulted in a different gene expression pattern. The toxicity mediated by Aβ(1-42) is probably not only induced by its oxidative potential.
Many of the genes affected by Aβ(1-42) were involved in apoptosis- and stress regulating pathways (MAPK-, Bcl2-family members).
The peptide also down regulated many genes present in the endoplasmatic reticulum (ER), Golgi apparatus and/or otherwise involved in protein modification and degradation, indicating a potential role of ER-mediated stress in Aβ-mediated toxicity. The mechanisms identified could presumably play a role in the cholinergic degeneration in AD.
Moreover, a number of genes, which are known to be involved in AD were identified. Aβ(1-42) changed the expression of cholinergic genes (vesicular acetylcholine transporter), of the lipid- (apolipoprotein J) and zinc- (zinc transporter) metabolism. These findings demonstrate the applicability of this cell culture model in AD research.
Most of the changes identified by microarray analysis were validated by quantitative real-time RT-PCR and the related proteins by Western-blotting/immunodetection.
This study supports recent findings of a major role of low-molecular weight Aβ-species in mediating cholinergic neurodegeneration in AD. The low-molecular weight forms are neurotoxic, enhance apoptosis and (ER)stress in the cells, which may account in part for the early-onset cholinergic degeneration before abundant accumulation of plaque formation appears.

Keywords:
Alzheimer-Erkrankung, cholinerges System, β-Amyloid, oxidativer Stress, Apoptose, MAPK, ER-Stress

Alzheimer's disease, cholinergic system, β-amyloid, oxidative stress, apoptosis, MAPK, ER-stress

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (2, 1-6)
1 Einleitung (7-24)
2 Material und Methoden (25-44)
3 Ergebnisse (45-72)
4 Diskussion (73-95)
5 Zusammenfassung / Summary (96-99)
6 Literaturverzeichnis (100-124)
Veröffentlichungen