Bianca Hust

Zur Rolle der Rezeptorkomponenten der Toc159-Familie in den Proteintransportkomplexen der äußeren Hüllmembran von Plastiden

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 09.11.2007

Abstract
Im Cytosol translatierte Vorstufenproteine werden über Multiproteinkomplexe in die Plastiden transportiert. In der äußeren Hüllmembran erfolgt die Erkennung und Translokation der Vorstufenproteine durch den Toc-Komplex. Der Toc-Kernkomplex setzt sich aus der Pore Toc75 und den Rezeptorproteinen Toc34 und Toc159 zusammen. Zu diesen ursprünglich aus Erbse isolierten Rezeptorproteinen existieren in Arabidopsis thaliana ganze Genfamilien mit zwei Vertretern für Toc34 (atToc33 und atToc34) und vier Vertretern für Toc159 (atToc159, atToc132, atToc120 und atToc90). Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein großer Komplex existiert der alle Rezeptorproteine gleichzeitig enthält, oder ob unterschiedliche Subkomplexe vorhanden sind. Für die Analyse der Komplexzusammensetzung wurden spezifische Antikörper gegen atToc159, atToc132 und atToc120 hergestellt und Arabidopsis T-DNA-Insertionsmutanten für atToc159, atToc132 und atToc120 isoliert. Mittels Coimmun-präzipitationen und BN-PAGE konnte gezeigt werden, dass atToc159, atToc132 und atToc120 jeweils eigenständige Komplexe bilden. Diese Komplexe weisen in der BN-PAGE eine Größe von ca. 800 kDa für atToc159, 600 - 800 kDa für atToc132 und 550 - 800 kDa für atToc120 auf. Alle Toc-Komplexe bestehen aus einem Rezeptorprotein der Toc159-Familie, der Pore atToc75 und den Rezeptorproteinen atToc33 bzw. atToc34. AtToc159 bildet gleichermaßen Komplexe mit atToc33 als auch atToc34, während atToc132 und atToc120 bevorzugt mit atToc34 interagieren. Die Charakterisierung der Arabidopsis T-DNA-Insertionsmutanten für atToc159, atToc132 und atToc120 ergab darüber hinaus, dass atToc159 andere Substrate als atToc132 und atToc120 besitzt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass es sich bei den Substraten von atToc159 sowohl um photosynthetische als auch nicht-photosynthetische Proteine handelt, die stark exprimiert werden. AtToc132 und atToc120 sind sehr wahrscheinlich für den Import von gering exprimierten Proteinen verantwortlich.

Nuclear encoded plastid proteins are recognised and transported into plastids via the Toc complex. The Toc complex is located in the outer envelope membrane of plastids and its core is composed of the pore forming protein Toc75 and two receptor proteins, Toc159 and Toc34. The latter are both encoded by small gene families in Arabidopsis thaliana with two homologs for Toc34 (atToc33 and atToc34) and four homologs for Toc159 (atToc159, atToc132, atToc120 and atToc90). It was analysed whether the Arabidopsis Toc receptors are all present together in one common complex or alternatively form different Toc complex subtypes. Specific antibodies against atToc159, atToc132 and atToc120 were produced for the characterisation of the complex composition. Moreover, T-DNA insertion mutants for atToc159, atToc132 and atToc120 were isolated. Coimmunoprecipitation and BN-PAGE experiments show that atToc159, atToc132 and atToc120 form separate complexes. The atToc159 complex has a size of roughly 800 kDa in the BN-PAGE. In contrast, the atToc132 complex migrates at approximately 600 - 800 kDa and atToc120 complexes at 550 - 800 kDa. All Toc complexes are composed of one Toc159 family member, the pore forming atToc75 and the receptor proteins atToc33 and atToc34, respectively. While atToc159 forms complexes with both atToc33 and atToc34, atToc132 and atToc120 preferentially associate with atToc34. The characterisation of the T-DNA insertion mutants shows in addition that atToc159 interacts with different substrates than atToc132 and atToc120. The results suggest that atToc159 substrates are highly abundant photosynthetic and non-photosynthetic proteins while atToc132 and atToc120 are involved in the import of low abundant proteins.

Keywords:
Chloroplast, Toc-Komplex, atToc159, atToc132, atToc120, T-DNA-Insertionsmutanten, BN-PAGE

chloroplast, Toc-complex, atToc159, atToc132, atToc120, T-DNA insertion mutants, BN-PAGE

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abbildungsverzeichnis, Tabellenverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1, I-X)
1 Einleitung (1-9)
2 Material und Methoden (10-47)
3 Ergebnisse (48-98)
4 Diskussion (99-113)
5 Zusammenfassung (114-115)
Literaturverzeichnis (116-128)
Publikationsliste (129)