Karen Blümke

Molekulargenetische Charakterisierung von disseminierten Tumorzellen und Karzinomen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 10.01.2008

Abstract
Disseminierte Zellen von Primärtumoren werden als Ursache einer Metastasenbildung und der Wiederkehr einer Tumorerkrankung angesehen. Der Nachweis dieser Zellen erlangt somit zunehmend an Bedeutung sowohl als klinisch relevanter Prognosefaktor als auch als Hilfe für Entscheidungen über eine adjuvante Therapie. Genomische Alterationen, die diese disseminierten Tumorzellen (DTZ) betreffen sind bisher weitestgehend unbekannt. Die DTZ aus dem peripheren Blut von Nierenzellkarzinompatienten, Mammakarzinompatientinnen und Prostatakarzinompatienten wurden mit Hilfe des magnetischen Zellanreicherungs-systems "MACS" (Fa. Miltenyi) angereichert und durch immunhistochemische Nachweisreaktionen detektiert. Im Anschluss daran sind die Tumorzellen mittels Laserdissektionsmikroskopie isoliert und die DNA dieser Zellen in einer "improved primer extension preamplification - PCR (I-PEP-PCR) amplifiziert worden. Die amplifizierte DNA wurde genutzt für die Bestimmung des Status verschiedener Mikrosatellitenmarker, wie Myc L1(1p32), Rb(13q14) und p53 Alu(17p13). Die Ergebnisse dieser Analysen wurden mit den Resultaten der Untersuchungen mit dem Primärtumorgewebe und dem Normalgewebe verglichen. Weiterhin wurden molekulare Veränderungen auf DNA-Ebene (LOH/MSI, Methylierungsstatus, SNP309) und Proteinebene (Expression von Survivin, uPA, uPAR und PAI) in den disseminierten Tumorzellen und in Karzinomgeweben bestimmt. Die Untersuchungsresultate wurden anschließend mit wesentlichen klinischen Parametern, wie Tumorgröße, -grad, -stadium, Lymphknotenbefall, Metastasierung und dem Gesamtüberleben korreliert.

Disseminated tumor cells (DTC) in peripheral blood are considered as the cause for the formation of metastases. Furthermore, their presence is increasingly regarded as a prognostic factor. However, genomic alterations that characterize DTC are still unknown. In order to assess the status of microsatellite instability (MSI) and loss of heterozygosity (LOH), a certain amount of DNA is required, but that is not available from only a limited number of DTC isolated from peripheral blood. In our study, we have applied the improved primer extension preamplification (IPEP) in order to amplify the genomic DNA from DTC of renal cell carcinoma patients, breast carcinoma patients and prostate carcinoma patients preceding the investigation of MSI and LOH in these cells. The DNA was subsequently used to determine the status of several microsatellite markers, e.g. MycL1, Rb, and p53 Alu. The results were compared to those of the primary tumor tissue, adjacent normal renal tissue, as well as, from peripheral blood lymphocytes.
Furthermore we have determined molecular alterations on DNA-level (LOH/MSI, methylation status, SNP309) and protein level (expression of survivin, uPA, uPAR und PAI) in disseminated tumor cells and tumor tissue. The results were correlated to essential clinical parameters as tumor size, grading, stage, lymph nodes, metastases and overall surviving.

Keywords:
disseminierte Tumorzellen, Mammakarzinom, Nierenzellkarzinom, Prostatakarzinom, Hypermethylierung, genomische Alterationen, Laserdissektionsmikroskopie, Mikrosatelliteninstabilität

disseminated tumor cells, breast carcinoma, renal cell carcinoma, prostate carcinoma, hypermethylation, genomic alterations, laser dissection microscopy, mikrosatellite instability

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (I-VII)
1. Einleitung (1-18)
2. Material (19-23)
3. Methoden (24-40)
4. Ergebnisse (41-75)
5. Diskussion (76-107)
6. Zusammenfassung (108-110)
7. Literaturverzeichnis (111-125)
8. Anhang (126-130)