Peter Asztalos

Untersuchungen zu molekularen, strukturellen und biokatalytischen Aspekten des Vitamin B1-abhängigen Enzyms Transketolase A aus Escherichia coli

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 20.02.2008

Abstract
Ziel der präsentierten Arbeit war das Verständnis der Katalyse des Vitamin B1-abhängigen Enzyms Transketolase A aus Escherichia coli auf molekularer Ebene. Hierzu wurden molekularbiologische Methoden (ortsgerichtete Mutagenesen) zur Generierung von aktiven-Zentren-Varianten sowie zur Einführung der Sequenz eines C-terminalen His6-tags genutzt. Durch den Vergleich von durch steady-state- (Aktivitätstest, Intermediatanalyse) und pre-steady-state-Messungen (stopped-flow-Absorptionsspektroskopie, Intermediatanalyse) bestimmten enzymkinetischen Parametern konnte der Einfluß einzelner Aminosäureseitenketten auf die Katalyse untersucht werden. Die Röntgenkristallographie mit Substrat-soaking-Technik erlaubte die Kristallisation der enzymgebundenen kovalenten Donorintermediate von D-Xylulose-5-phosphat und D-Fructose-6-phosphat sowie des nicht-kovalenten Akzeptorsubstrat-Enzymkomplexes von D-Ribose-5-phosphat in der docking-site der Transketolase A. Der Einsatz von Cofaktor-Analoga gestattete die Untersuchung unterschiedlicher Ausprägungen von Banden im CD-Spektrum. Zudem ließ sich eine bisher für Transketolase nicht beschriebene Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS)-ähnliche Carboligationsreaktion zeigen.

The aim of the work presented here was the understanding of catalysis of the vitamin B1-dependent enzyme transketolase A from Escherichia coli on a molecular level. In this concern methods of molecular biology (site directed mutagenesis) were used to generate active-site variants as well as for the introduction of a sequence for a C-terminal His6-tag. By comparison of steady-state (activity, analysis of covalent intermediates) as well as pre-steady-state investigations (stopped-flow absorbance, analysis of covalent intermediates) the influence of active-site residues on catalysis were examined. The application of X-ray crystallography with substrate-soaking technique allowed the crystallization of the enzyme-bound covalent donor intermediates of D-xylulose 5-phosphate and D-fructose 6-phosphate as well as the non-covalent acceptor-substrate-enzyme-complex of ribose 5-phosphate in the docking site of transketolase A. Coenzyme analogues were used to analyse different positions of bands observed in the CD spectra. Furthermore, a hitherto undescribed acetohydroxyacid synthase (AHAS)-like carboligation reaction was shown for the enzyme.

Keywords:
Transketolase A, Escherichia coli, kovalente Intermediate, ThDP (Thiamindiphosphat), near attack-Konformer, Auslenkungswinkel, Röntgenkristallographie, Intermediatanalyse, Circulardichroismus, AHAS-ähnliche Reaktion

transketolase A, Escherichia coli, covalent intermediates, ThDP (thiamine diphosphate), near attack conformer, out-of-plane distortion, x-ray crystallography, analysis of covalent intermediates, circular dichroism, AHAS-like reaction

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Abkürzungen und Symbole, Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung (1-10)
2. Materialien & Methoden (11-41)
3. Ergebnisse & Diskussion (42-112)
4. Zusammenfassung & Ausblick (113-117)
5. Referenzen (118-130)
6. Anhang (131-142)