Mabruk Erhuma H. Erhuma

Expression und Funktion von NEP/CD10 in Pankreaskarzinom-Zelllinien

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 17.03.2008

Abstract
In dieser Arbeit wurde die zellbiologische Rolle von NEP/CD10 beim exokrinen Pankreaskarzinom untersucht. Als Modelle wurden für diese Studie verschiedene Pankreaskarzinomzelllinien, insbesondere die Zelllinie PANC-1, welche aus einem undifferenzierten Pankreaskarzinom gewonnen wurde, verwendet. Die folgenden zellbiologischen Parameter wurden (mit an die Bedingungen der Pankreaskarzinom-Zelllinien adaptierten Methoden) quantitativ und qualitativ erfasst: mRNA Expression (Realtime-PCR), Protein Expression (mittels Durchflusszytometrie), Enzymaktivität (enzymatisch), Zellproliferation (MTT-Test), Zellmotilität (Migrationstest mit Transwellkammern) und andere. Die folgenden Punkte beinhalten die wesentlichen Ergebnisse:
Von allen untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien zeigten nur die Zelllinien, welche nicht die Fähigkeit zur Metastasierung besitzen, die Expression von NEP/CD10.
Durch die Methylierung mittels 5-aza-deoxy-2-cytidin konnte die Expression von NEP/CD10 in den untersuchten Pankreaskarzinomzellen nicht induziert werden.
Reagenzien für die Azetylierung wie Butter- oder Valproinsäure konnten die Expression von NEP/CD10 in Pankreaskarzinomzellen, welche NEP/CD10 exprimieren, hoch regulieren. Auf der anderen Seite zeigte sich, dass die Expression von NEP/CD10 in Zelllinien, welche dieses Gen nicht exprimieren, nicht durch eine Azetylierung induziert werden konnte.
Die aggressive Pankreaskarzinomzelllinie PANC-1, welche ein erhöhtes Proliferations- und Invasionspotential besitz, zeigte in vitro nach Transfektion mit dem Wildtyp von NEP/CD10, ein erniedrigtes Proliferations- und Invasionsverhalten. Andererseits veränderte sich die Proliferations- und Invasionsrate nicht, wenn diese mit einer Mutante des NEP/CD10 Gens transfiziert wurde.
Aus den Daten lässt sich schließen, dass eine Überexpression von NEP/CD10 einen indirekten Einfluss auf die Signalkaskaden (up- und downstream) hat, welche für die Auslösung und Regulation der Proliferation und Motilität verantwortlich sind. Dabei könnte eine Überexpression von NEP/CD10 einen inhibierenden Einfluss in diesen Kaskaden durch den Abbau bioaktiver Peptide ausüben.

In this study to explain the cell biological role of NEP/CD10 in controlling pancreatic adenocarcinoma progression, PANC-1 cell line was used as models that derived from poorly differentiated pancreas carcinomas.
In the examined exocrine pancreatic carcinoma cell lines only the cell lines that have no ability to metastasis express NEP/CD10.
Demethylating reagent 5-aza-deoxy-2-citydine could not restore expression of NEP/CD10 in the examined pancreatic adenocarcinoma cell lines.
Acetylating reagents such as butyric acid and valproic acid could upregulate expression of NEP/CD10 in the cell line that already expresses NEP/CD10, but could not restore NEP/CD10 in the cell lines that do not express NEP/CD10.
PANC-1, an aggressive pancreatic adenocarcinoma cell line that has enhanced proliferation and invasive potential rate, shows after transfection with wild type NEP/CD10 gene that, proliferation and invasive potential rate was reduced in vitro. On the other hand after transfection with mutated NEP/CD10, the proliferation and invasive potential rate was marginally or not reduced in vitro.
NEP/CD10 over expression has indirect influence on upstream and down stream signal cascades that regulate proliferation and motility rate. This postulate as one of the possible mechanisms of NEP/CD10 over expression one that works via controlling bioactive peptides. Binding to their cell membrane receptors and initiation of signal cascades is partially dependent on enzyme active site.

Keywords:
Neutraler Endopeptidase (NEP/CD10), Pankreaskarzinom, Histondeacetylaseninhibitoren, Demethylierungreagenz

neutral endopeptidase (NEP/CD10), pancreatic carcinoma, histone deacetylase inhibitors, demethylating reagent

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Inhaltsverzeichnis
Front page, Contents, Abbreviations (I-VII)
1 Introduction (1-15)
2 Materials and Methods (16-36)
3 Results (37-58)
4 Discussion (59-68)
5 Conclusion (69-71)
6 Prospective plane (72)
7 References (73-92)
Publications (93-94)