Johannes Hohlbein

Single Molecule Fluorescence Detection in Nanoscale Confinement

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät II der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 31.03.2008

Abstract
Der erste Teil der Dissertation beschäftigt sich mit dem Gebrauch von nanoporösen Aluminiumoxidmembranen um die Diffusion von einzelnen fluoreszierenden Molekülen in zwei Dimensionen einzuschränken. Dadurch werden die Sondenmoleküle gezwungen, parallel zur langen Achse des Laserfokus eines konfokalen Mikroskops zu diffundieren. Dies führt, im Vergleich zu Standardmessungen in freier Lösung, zu einer deutlich erhöhten Diffusionszeit der Moleküle durch den Fokus. Im Gegensatz zu den in der Literatur vorgeschlagenen Methoden, kombiniert diese Methode die verlängerte Beobachtungszeit mit einer Verkleinerung des effektiven Detektionsvolumens indem ein Großteil der Lösung durch den definierten porösen Festkörper verdrängt wird. Weiterhin können die Sondenmoleküle verwendet werden, um unterschiedliche Eigenschaften der Membran wie zum Beispiel Porosität, Brechungsindex und chemisches Verhalten der Porenwände zu bestimmen und zu charakterisieren.
Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der dreidimensionalen Orientierungs-bestimmung des Emissionsdipols von einzelnen Molekülen mit dem Ausblick, die Rotationsanisotropie von Molekülen in Membranen zu untersuchen. Ein neues Detektionsschema wird vorgestellt, welches eine nur durch Schrotrauschen limitierte Orientierungsbestimmung erlaubt. Dazu benutzt die Methode eine raffinierte Verteilung der detektierten Fluoreszenz auf drei Detektoren. Es wird sowohl durch Experimente als auch durch Simulationen gezeigt, dass schon die Detektion von einige hundert Photonen ausreicht, die Orientierung mit geeigneter Genauigkeit zu bestimmen.
Die vorliegende Arbeit widmet sich der Entwicklung von neuen Werkzeugen und Konzepten für die konfokale Mikroskopie und der Einzelmoleküldetektion im engen Wechselspiel mit den Materialwissenschaften. Die vorgestellten Methoden haben ein großes Potential und können auf vielfältigste wissenschaftliche Fragestellungen angewendet werden.

The first part of this thesis is about the use of nanoporous alumina membranes for creating a two-dimensional geometrical confinement for the diffusion of single fluorescent molecules. Thereby, the probe molecules are forced to diffuse parallel to the long axis of the laser focus of a confocal microscope resulting in a massively prolonged diffusion time of the molecules within the focus compared to measurements in free solution. In contrast to methods proposed in literature, this method combines the prolonged observation time with a decreased effective detection volume by replacing a large fraction of the dye containing solution with the well-defined porous solid. Moreover, the probe molecules can be used to determine different properties of the membrane such as porosity, refractive index and the chemical behavior of the pore walls.
The second part of this thesis is about the three-dimensional orientation determination of the emission dipole of single molecules with the perspective of studying the confinement effects on rotational anisotropy. A new detection scheme is proposed, which allows a shot-noise-limited orientation determination. This method uses a sophisticated distribution of the detected fluorescence into a set of three detectors. In fact, as shown by various simulations and experiments, several hundreds of detected photons are sufficient to determine the orientation with appropriate accuracy.
In conclusion, this work is focused on the development of new tools and concepts in optical confocal microscopy and single molecule detection in tight interplay with materials science. These methods show a high potential and can be easily applied to a wide range of scientific areas.

Keywords:
Einzelmolekülfluoreszenzdetektion, poröse Aluminiumoxidmembranen, konfokale Mikroskopie, Diffusion, 3D-Orientierungsbestimmung, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

single molecule fluorescence detection, porous alumina, confocal microscopy, diffusion, 3D-orientation determination, fluorescence correlation spectroscopy

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Inhaltsverzeichnis
Front page, Contents, Nomenclature (i-iv, 1)
1 Introduction (2-4)
2 Single molecule spectroscopy: fundamentals and beyond (5-21)
3 Materials and methods (22-28)
4 Fluorescent molecules diffusing in confinement (29-58)
5 3D-orientation determination of single molecules (59-85)
6 Conclusion and outlook (86-89)
Bibliography (90-97)
Scientific contributions