Usha Rani Dutta

Molecular characterization of a pericentric inversion of chromosome 3 in a 3-generation family with short stature

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 04.03.2008

Abstract
Die molekulare Charakterisierung von balanciert auftretenden Chromosomenveränderungen, die mit einem spezifischen klinischen bild einhergehen, haben in vielen Fällen zur Identifizierung Krankheitsverursachender Gene geführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die positionale Klonierung eines Gens in einer 3-Generationen Familie, in der eine perizentrische Inversion mit Kleinwuchs assoziiert ist. Mittels der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurden beide Bruchpunkte der Inversion 46,XX,inv(3)(p24.1q26.1) kartiert. BAC CTD-2000B5 und BAC RP11-12N13 überspannen neben anderen Vektoren den 3p bzw. 3q Bruchpunkt. Zur weiteren Eingrenzung wurden Restriktionsfragmente bzw. Long range PCRFragmente dieser BACs als FISH Sonden eingesetzt und die Bruchpunktregionen darüber auf ein 2.9 kb Segment in 3p und ein 5.3 kb Segment in 3q eingegrenzt. Die in silico Analyse der genomischen Sequenz ergab einen Anteil von ca. 30% an repetitiven Elementen (3p:LTR3A, MER67C, L2, MER67D; 3q: LTR16C, MER20, MLT2B1, LTR1B). Beide Bruchpunkte kartieren innerhalb dieser Bereiche. Keiner der beiden Bruchpunkte befindet sich innerhalb eines bekannten Gens. Die in silico Analyse ergab allerdings ein putatives Gen in 3q26.1 mit 12 Exons, einer 1.952 bp großen mRNA und einem ORF von 652 Aminosäuren. Der Bruchpunkt befindet sich in Intron 2. Das putative Gen ist homolog zu PSAT1 auf Chromosom 9. Nach RT-PCR Analyse ergab sich bisher kein Hinweis auf eine Expression im Gehirn bzw. Testis. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob dieses Gen, bzw. flankierende Gene in 3p bzw. 3q durch die Inversion in ihrer Funktion beeinträchtigt sind.

Chromosomal rearrangements associated with a disease phenotype have often led to the identification of novel disease genes. Here we report a 3-generation family in which short stature is being associated with a heterozygous pericentric inversion of 46, XX,inv(3)(p24.1q26.1). We used fluorescence in situ hybridization (FISH) to physically characterize the breakpoint regions. FISH analyses showed that among others the Bacterial artificial chromosome (BAC) CTD-2000B5 and BAC clone RP11-12N13 were spanning the 3p and 3q breakpoints, respectively. In order to further narrow down the breakpoint regions subcloned fragments of the breakpoint spanning BACs as well as long range PCR products were used as probes for FISH. The breakpoints were thus located within a region of 2.9 kb and 5.3 kb on p and q respectively. Analysis of the genomic sequence surrounding the inversion breakpoints revealed 30% repetitive elements containing LTR33A, MER67C, L2 and MER67D elements on p region and LTR16C, MER20, MLT2B1, LTR1B, simple repeats and low copy repeats on q region. We determine that the breakpoints occurred between these repetitive regions. Neither of the inversion breakpoints was found to disrupt a validated gene, however, a novel putative gene was identified at 3q26.1 by in silico analysis. The putative gene has 12 exons, a 1.952 bp mRNA showing a single ORF with 652 amino acids. The breakpoint was found to disrupt the 2nd intron of this putative gene. This gene shows homology to PSAT1 on chromosome 9. No transcript was identified so far in cDNA of human brain and testis. Further expression studies could shed some light on the nature of this putative gene.

Keywords:
Positionale Klonierung, perizentrische Inversion, Chromosom 3 des Menschen, Kleinwuchs, Fluoreszenz in situ Hybridisierung, chromosomale Bruchpunkte, repetitive Elemente, Long Range PCR, in silico Analyse

Positional cloning, pericentric inversion, human chromosome 3, short stature, Fluorescence in situ hybridization (FISH), chromosomal breakpoint, repetitive elements, Long Range PCR, in silico analysis

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Inhaltsverzeichnis
Front page, Contents, Abbreviations (1, i-x)
1 Introduction (1-13)
2 Materials and Methods (14-60)
3 Results (61-111)
4 Discussion (112-127)
5 Summary (128)
6 References (129-144)
7 Appendix (A-F)