Doreen Manuela Floß

Expression von anti-HIV-1 Antikörper-ELP-Fusionen in Nicotiana tabacum: Biochemische und funktionelle Charakterisierung

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 30.06.2008

Abstract
Pflanzen können als Expressionssysteme zur Produktion von rekombinanten Proteinen für Human- und Veterinärmedizin genutzt werden. Die Antikörperketten von zwei HIV-1 neutralisierenden Immunglobulinen (2F5 & 2G12) wurden in der vorliegenden Arbeit mit elastinähnlichen Polypeptiden (ELP) fusioniert, um eine Akkumulationssteigerung der rekombinanten Proteine in transgenen Tabakpflanzen zu erzielen und die Reinigung der Antikörper zu vereinfachen. Kreuzungen ausgewählter Pflanzen mit Expression der verschiedenen Immunglobulingene resultierten in vier verschiedenen Antikörpervarianten: Ohne ELP, mit ELP an leichten oder schweren Ketten bzw. mit ELP an allen vier Antikörperketten. Eine Steigerung der Akkumulation aufgrund der Fusion mit ELP wurde für die einzelnen Antikörperketten und die vollständigen Immunglobuline nachgewiesen. Durch die Nutzung der Doppelhaploiden-Technik wurden stabile, homozygote Tabaklinien mit Akkumulation kompletter Antikörper erzeugt. Die durch Affinitätschromatographie gereinigten Immunglobuline und ELP-Fusionen aus Tabakblättern wurden hinsichtlich ihres Bindeverhaltens zum jeweiligen Antigen (gp41 bzw. gp120) mit Oberflächen-Plasmon-Resonanz näher charakterisiert und zeigten keine Unterschiede zum Standardantikörper aus tierischen Zellen (Chinese hamster ovary cells). Am Fc-Teil aller rekombinanten Antikörper wurden überwiegend N-Glycane vom oligo-mannosidischen Typ identifiziert. Im Gegensatz zu den rekombinanten 2F5 Antikörper-ELP-Fusionen neutralisierten 2G12 Antikörpervarianten aus Tabakpflanzen HI-Viren in vitro. Die Faltung, Zusammenlagerung und der Transport aller Antikörpervarianten wurden durch ELP-Fusion nicht behindert. Erste Experimente zur ELP-basierten Reinigung der rekombinanten Proteine führten zu einer starken Anreicherung der Antikörperfusionen aus Pflanzenextrakten.

Plants are promising vehicles for the expression of recombinant proteins with regard to medical and veterinary purposes. In order to enhance the accumulation of two HIV-1 neutralizing antibodies (2F5 & 2G12) in tobacco plants and to simplify the purification, synthetic repeats of elastin- like polypeptides (ELPs) were C-terminally fused to both antibody chains. Crossing of transgenic plants with accumulation of the individual antibody chains in all combinations resulted in transgenic lines producing the complete antibodies in four formats, with ELP on either the light or heavy chains, on both or on neither. An increase of the expression caused by ELP fusion was confirmed for the individual antibody chains and for the full-length antibodies. Homozygous tobacco lines were produced by embryogenic pollen culture and the genome of the generated haploids was doubled. Characterization of the affinity-purified antibodies from tobacco leaves by surface plasmon resonance spectroscopy showed that the kinetic binding parameters were identical to those of in CHO (Chinese hamster ovary) cells produced counterparts lacking ELP. N-Glycan analysis of these preparations revealed that all four derivatives of 2F5 and 2G12 contained predominantly oligo-mannose type N-glycans. In vitro neutralization assays demonstrated that the HIV-1 inactivation capacity of the tobacco produced 2G12 was equivalent or even better compared to the CHO standard. ELP fusions do not interfere with folding, assembly, trafficking in the secretory pathway, or post-translational modification. First experiments on the enrichment of recombinant antibody ELP fusions in tobacco leaf extracts were performed and indicated a simplified recovery of the recombinant proteins.

Keywords:
molecular pharming, anti-HIV Antikörper, elastinähnliche Polypeptide (ELPs), transgene Pflanzen, Oberflächen-Plasmon-Resonanz, N-Glycosylierung, Doppelhaploiden-Technik

molecular pharming, anti-HIV antibodies, elastin- like polypeptides (ELPs), transgenic plants, surface plasmon resonance, N-glycosylation, doubled haploid technology

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis, Tabellen und Abbildungen
I Einleitung (1-16)
II Material und Methoden (17-39)
III Ergebnisse (40-90)
IV Diskussion (91-113)
V Zusammenfassung (114-115)
VI Literatur (116-132)
VII Anhang
Publikationsliste