Enguo Fan

Analysis of the dynamic property of Tat translocase and the fate of Tat signal peptides

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 20.08.2008

Abstract
Der Zwillingsarginin- (Tat-) Transportweg kann gefaltete Proteine über die Thylakoid-membran von Chloroplasten und die Plasmamembran von Bakterien transportieren. In dieser Arbeit wurden folgende Aspekte des Tat-Wegs untersucht:
(1) Evolutionäre Konservierung der Transportinformation des Tat-Transportwegs: In Cryptophyten sind die Phycobiline wie das Phycoerythrin (PE) auf der luminalen Seite der Thylakoidmembran lokalisiert. Um herauszufinden wie diese Proteine sortiert werden, wurden die Transporteigenschaften eines Phycoerythrins, des PEα, analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Tat-Translokase den Transport von PEα in das Thylakoidlumen vermittelt. Diese Analyse legt den Schluss nahe, dass auch in den Plastiden der Crytophyten ein Proteintransportweg existiert der dem Tat-Weg in Chloroplasten höherer Pflanzen entspricht und dass deren Transportinformation evolutionär konserviert ist.
(2) Analysen zum Mechanismus des Tat-Transportprozesses: Viele Modelle postulieren, dass die Tat-Translokase eine dynamische und transient geformte Translokase ist. Um experimentelle Beweise dafür zu erhalten, wurde ein "Zug-ähnliches" Protein (16/23-EGFP), in dem EGFP (Verstärkt Grün-Fluoreszierendes Protein) mittels eines kleinen Verbindungs-peptids an den C-Terminus des chimären 16/23 Proteins angehängt wurde, konstruiert und analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Thylakoidtransport dieses chimären Proteins an definierten Stellen signifikant verzögert war, was zur Bildung von drei Transport-intermediaten führte. Zeitverlaufs-, Kompetitions- und auch Immunopräzipitations-experimente wurden durchgeführt um diese Transportintermediate näher zu charakterisieren. Die Ergebnisse zeigen, dass ein einzelnes, Tat-dirigierendes Signalpeptid den Transport von zwei verschiedenen Passagierproteinen erlaubt. Des Weiteren wird das chimäre 16/23-EGFP wahrscheinlich nach einem "Schritt für Schritt" Mechanismus transportiert. Dies stützt eine Theorie nach der sich die Tat-Translokase im Zuge des Transportprozesses dynamisch an verschiedene Größen und Formen des Transportsubstrates anpassen kann.
(3) Analysen zum Verbleib des Tat-Signalpeptids nach Freisetzung durch die Thylakoid-Prozessierungspeptidase: Um den Verbleib des Tat-Signalpeptids nach Translokation und dessen Abspaltung von dem Vorläuferprotein durch die Thylakoid-Prozessierungspeptidase zu analysieren, wurden ein "Tandem-Substrat", bestehend aus zwei hintereinander geschalteten Vorläuferproteinen, sowie Derivate desselben konstruiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Tat-Signalpeptide nach dem Tat-Transport und der Freisetzung durch die Thylakoid-Prozessierungspeptidase in weitere Subfragmente geschnitten werden. Beide Vorgänge sind notwendig für die folgende Signalpeptidspaltung. Wahrscheinlich katalysiert eine Metalloprotease diese Spaltung, wie Untersuchungen mit verschiedenen Arten von Proteaseinhibitoren gezeigt haben. Diese Daten liefern die ersten Ergebnisse zum Verbleib der Tat-Signalpeptide in der Thylakoidmembran.

The twin arginine translocation (Tat) pathway can transport folded proteins across the thylakoid membrane of chloroplasts and the plasma membrane of bacteria. This thesis investigated the following aspects of Tat pathway:
(1) Evolutionary conservation of the targeting information of the Tat pathway: In cryptophytes, the phycobilins like phycoerythrin (PE) are located on the lumenal side of the thylakoid membrane. To analyze how these proteins are sorted, the transport properties of one phycoerythrin, PEα, were analyzed. The results show that Tat translocase mediates the translocation of PEα into the thylakoid lumen. This analysis strongly suggests that a protein transport pathway corresponding to the Tat pathway of higher plant chloroplasts exists also in cryptophyte plastids and that their targeting information is evolutionary conversed.
(2) Analyses of the mechanism of the Tat transport process: Many models have speculated that the Tat translocase is a dynamic and transiently formed translocon. To provide experimental evidence, a "train-like" protein (16/23-EGFP), in which EGFP (enhanced green fluorescent protein) was attached to the C-terminus of the 16/23 chimeric protein by use of a small peptide linker, has been constructed and analyzed. The results show that the thylakoid transport of this chimeric protein was significantly retarded at individual steps giving rise to three transport intermediates. Time course, competition as well as immunoprecipitation experiments were carried out to further characterize these transport intermediates. The results indicate that a single Tat-targeting signal peptide allows the transport of two different passenger proteins. Furthermore, the 16/23-EGFP chimera is probably transported in a step-by-step manner. This supports the idea that the Tat translocase could dynamically adapt to different sizes and shapes of the cargo substrates in the course of the transport process.
(3) Analyses of the fate of Tat signal peptides after release by the thylakoid processing peptidase: To analyze the fate of Tat signal peptides after translocation and release by the thylakoid processing peptidase from the precursor, a "tandem-substrate'" which is composed of two precursors fused in series as well as derivatives thereof have been constructed. The results show that Tat signal peptides are cleaved into subfragments after Tat transport and processing by the thylakoid processing peptidase. Both events are necessary for the subsequent signal peptide cleavage. Probably a metalloprotease catalyzes this cleavage, as shown by testing different types of protease inhibitors. These data provide the first results on the fate of Tat signal peptides within the thylakoid membrane.

Keywords:
Thylakoidmembran; Proteintransport; Tat-Weg; Zwillingsarginin; Cryptophyten; Phycoerythrin; Transportmechanismus; Translokationsintermediat; Signalpeptidspaltung; Metalloprotease

thylakoid membrane; protein transport; Tat pathway; twin arginine; cryptophytes; phycoerythrin; transport mechanism, translocation intermediate; signal peptide cleavage; metalloprotease

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Inhaltsverzeichnis
Front page, Contents, List of abbreviations, Summary (1, I-V, 1-2)
1 Introduction (3-16)
2 Materials and Methods (17-28)
3 Results and Discussion (29-72)
References (73-90)
List of publications