Heidi Becker

The rainbow trout glucocorticoid receptors: A mechanistic and toxicological study

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 16.06.2008

Abstract
Glukokortikoide übernehmen eine wesentliche Rolle während der Regulation von vielfältigen physiologischen Prozessen im Organismus. Sie greifen regulierend in die Immunantwort, in Abläufe im Gehirn und in den Energiemetabolismus ein, regulieren den Elektrolythaushalt, den Blutdruck und die Stressantwort. Die Antwort der Glukokortikoide wird durch Glukokortikoid-Rezeptoren (GR) vermittelt. In verschiedenen Vertretern der Knochenfische konnten zwei Glukokortikoid-Rezeptorgene (rtGR1 und rtGR2) beschrieben werden, welche das Ergebnis einer frühen Genomduplikation sind. Die beiden Glukokortikoid-Rezeptoren der Regenbogenforelle weisen interessante Unterschiede in ihrer Hormonsensitivität in Transaktivierungs- und Transrepressionsstudien auf. Der rtGR2 übt seine Aktivität bei deutlich niedrigeren Konzentrationen von Cortisol aus, verglichen mit dem rtGR1 (Bury et al., 2003). Es wird diskutiert, dass die Signalweitergabe der Glukokortikoide durch die subzellulare Verteilung der entsprechenden Rezeptoren beeinflusst wird. Der Transfer der Rezeptoren in den Zellkern folgte denselben hormonellen Unterschieden, welche bereits in Transaktivierungs- und Transrepressionsstudien bekannt wurden. Der Import von rtGR2 in den Zellkern wurde bei niedrigeren Konzentrationen, verglichen mit dem Import von rtGR1, ausgelöst. Im Kontrast zu der in Säugetieren beschriebenen Situation war ein Großteil der unstimulierten Regenbogenforellen-Rezeptoren konstitutiv im Zellkern nachweisbar. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Proteindomäne A/B eine bisher unbekannte Komponente beinhaltet, welche den Rezeptor, auch in Abwesenheit des Liganden, in den Zellkern verschieben kann.
Nur wenige Studien beschreiben bisher den Einfluss von Umweltschadstoffen auf die Funktion des GR in Säugetieren und nur vereinzelt wurden toxikologische Studien des rtGR1 durchgeführt. In der vorgestellten Arbeit wurde erstmalig das Eingreifen von Schadstoffen in den ungestörten Ablauf der Antwort beider Regenbogenforellen-GR beleuchtet. Cadmium und Kupfer, das entzündungshemmenden Medikament Diclofenac und Nonylphenol übten den größten Einfluss auf die Funktionen des rtGR1 und rtGR2 aus. Cadmium hemmte wirkungsvoll den Transport der Rezeptoren in den Zellkern, sowie die nachgeschaltete Aktivierung von Zielgenen. Diclofenac griff ebenfalls hemmend in den Transport der Rezeptoren in den Zellkern und die Aktivierung von Zielgenen ein. Nonylphenol hingegen erhöhte die Geschwindigkeit des Transportes in den Zellkern und verstärkte die Aktivierung von Zielgenen.

Glucocorticoids play an essential role in the regulation of key physiological processes, including immune response, brain function, energy metabolism, electrolyte balance, blood pressure and stress response. The action of glucocorticoids is mediated by the glucocorticoid receptor (GR). Phylogenetically diverse teleost fishes have been shown to possess two GRs that arose following a whole genome duplication event that occurred early in the teleost lineage. The two rainbow trout glucocorticoid receptors, termed rtGR1 and rtGR2, display a marked difference in their hormone sensitivity in transactivation and transrepression assays, with rtGR2 exerting its activity at far lower concentrations of cortisol compared to rtGR1 (Bury et al 2003). Glucocorticoid signal transduction is regulated by the subcellular distribution of the GRs and first determinants of subcellular localisation and nuclear translocation of rtGR1 and rtGR2 using GFP-tagged receptor proteins was observed. Tracking to the nucleus showed the same differences in hormonal sensitivity as those previously found in transactivation or transrepression studies. rtGR2 nuclear transfer was more sensitive to cortisol than rtGR1 nuclear translocation. However, in strong contrast to mammalian GR we observed that the majority of the naive trout GRs were constitutively localised in the nucleus. Further studies using domain swap mutants showed that this unusual cellular distribution is due to an undefined component of the A/B-domain.
Only few studies have so far addressed the impact of contaminants on mammlian GR action and even fewer studies have investigated the impact of environmental contaminants on teleost rtGR1 and no study ever has been conducted about rtGR2 by contaminants. The impact of a set of contaminants on the action of both trout receptors on the level of the nuclear import of the receptor and transactivation of target genes is described. Nonylphenol, TCDD, PCB, heavy metals, and pharmaceuticals were investigated. Of all substances tested, the heavy metals copper and cadmium, the non steroidal anti-inammatory drug diclofenac, and the alkylphenol nonylphenol had the greatest impact on trout GR action. Cadmium was a potent inhibitor of nuclear transfer and of transactivation activity of both rtGR1 and rtGR2. Diclofenac impaired nuclear transfer and transactivation activity of both rtGRs. Nonylphenol was able to increase nuclear transfer rates and transactivation of target genes.

Keywords:
Glucocorticoid-Rezeptoren, Stress, Nonylphenol, Diclofenac, Regenbogenforelle, GFP, Transfer in Zellkern, Oncorhynchus mykiss, Endocrine Disruption, Cadmium

glucocorticoid receptors, stress, nonylphenol, diclofenac, rainbow trout, GFP, nuclear transfer, Oncorhynchus mykiss, endocrine disruption, cadmium

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Inhaltsverzeichnis
Title page, Contents, List of Tables, List of Figures, Abbreviations, Summary, Zusammenfassung (2, i-xii)
1 Introduction (1-12)
2 Material and Methods (13-26)
3 Results (27-50)
4 Discussion (51-59)
5 Concluding Remarks and Future Directions (60-61)
6 References (62-74)
Appendix (xiii-xix)