Peter Hanner

Untersuchungen zum Einfluss des Faltungszustandes von Vorläuferproteinen auf den Tat-abhängigen Proteintransport sowie zur subzellulären Lokalisierung potentieller Thylakoidprozessierungspeptidasen in Arabidopsis thaliana

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 05.11.2008

Abstract
Der Tat-Weg (twin arginine translocation) ist einer von vier Proteintransportwegen an der Thylakoidmembran. Dieser Transportweg wird vom Protonengradient über der Thylakoidmembran energetisiert; stromale Faktoren oder Nukleosidtriphosphate werden dagegen nicht benötigt. Die Substrate des Tat-Weges tragen Signalpeptide mit einem charakteristischen Zwillingsarginin-Motiv, welches auch namensgebend für den Transportweg war. Eine Besonderheit des Tat-Weges ist die Fähigkeit, vollständig gefaltete Proteine zu transportieren. Strukturuntersuchungen der chimären Tat-Substrate 16/EGFP und i16/EGFP mittels CD-Spektroskopie und IRRAS konnten zeigen, dass diese bei der Interaktion mit hydrophoben Grenzflächen a-helikale Strukturen im Signalpeptid ausbilden. Vergleichende Untersuchungen zum Einfluss des Faltungszustandes des Substrats auf den Transport ergaben, dass die Tat-Substrate sowohl in gefalteter als auch in ungefalteter Form als Kompetitorproteine wirksam sind, wobei das gefaltete Substrat einen stärkeren Kompetitor darstellt Die Thylakoidprozessierungspeptidase (TPP) ist eine Typ I-Signalpeptidase, welche die terminale Prozessierung von Proteinen nach deren Transport über die Thylakoidmembran katalysiert. Arabidopsis thaliana trägt drei Gene, die für Proteine codieren, welche homolog zu den Typ I-Signalpeptidasen aus E.coli und Synechocystis sp. sind (TPP1, TPP2, TPP3). In silico-Analysen wiesen insbesondere für TPP3 eine starke Homologie zu diesen bakteriellen Peptidasen nach. In organello-Importstudien mit isolierten Chloroplasten und Mitochondrien zeigten eine plastidäre Lokalisierung der TPP3, während TPP1 und TPP2 in Mitochondrien importiert wurden. TPP3 zeigte nach dem Import eine transmembrane Topologie in der Thylakoidmembran, was nahelegt, dass es sich bei diesem Protein tatsächlich um die funktionelle, plastidäre Thylakoidprozessierungspeptidase handelt. In vivo-Untersuchungen mittels transienter Transformation von geeigneten chimären Reportergenkonstruktionen bestätigten die in organello Ergebnisse für TPP3, zeigten jedoch für TPP1 und TPP2 keine eindeutige Lokalisierung, da je nach Fusionsprodukt auch eine duale Lokalisierung in Plastiden und Mitochondrien gefunden wurde.

The Tat-pathway (twin arginine translocation) is one of four protein transport pathways operating at the thylakoid membrane. Transport is energized by the proton gradient across the thylakoid membrane and is independent of stromal factors or nucleoside triphosphates. The Tat-substrates contain signal peptides that are characterized by a twin pair of arginine residues. A characteristic feature of this pathway is its ability to translocate folded passenger proteins. Structure analyses of the chimeric Tat-substrates 16/EGFP and i16/EGFP via Cdspectroscopy and IRRAS have shown that the signal peptides of these substrates develop a-helical structures when interacting with hydrophobic surfaces. Analyzing the influence of the folding state of the substrate on the transport process has shown that the chimeric substrates are functional competitors both in the folded and the unfolded state. Remarkably though the folded form has a stronger competition effect.
The thylakoid processing peptidase (TPP) is a type I signal peptidase which carries out the terminal processing of proteins after their transport across the thylakoid membrane. In Arabidopsis thaliana three genes, encoding proteins with homology to type I signal peptidases of E.coli and Synechocystis sp., have been identified (TPP1,TPP2,TPP3). In silico analyses have shown that especially TPP3 shows strong homology to the bacterial peptidases. In organello import experiments demonstrate that TPP3 is indeed transported into chloroplasts while TPP1 and TPP2 are targeted to mitochondria instead. After import into chloroplasts, TPP3 is found inserted into the thylakoid membrane in a transmembrane topology which suggests that TPP3 is the functional thylakoid processing peptidase. In vivo analyses by transient transformation of suitable reportergene constructs have confirmed the in organello results of TPP3 but could not unambiguously clarifies the localisation of TPP1 and TPP2, since in some cases the two proteins showed dual localisation both, in mitochondria and plastids.

Keywords:
Tat-Substrate, EGFP, Signalpeptidstruktur, Proteinfaltung, Thylakoidmembran, Proteintransport; Tat-Weg; Zwillingsarginin, Thylakoidprozessierungspeptidase, TPP

Tat-substrates, EGFP, signal peptide structure, protein folding, thylakoid membrane, protein transport, twin arginine, thylakoid processing peptidase, TPP

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abbildungsverzeichnis, Tabellenverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (2, I-XIII)
1 Zusammenfassung (1-2)
2 Einleitung (3-20)
3 Ergebnisse (21-86)
4 Diskussion (87-109)
5 Material und Methoden (110-138)
Literaturverzeichnis (139-161)
Publikationsliste