Vera Götze

Die Wirkung von Di- und Tripeptiden auf funktionelle Parameter von humanen Endothelzellen der Aorta

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Ernährungswissenschaften (Dr. troph.) vorgelegt an der Naturwissenschaftlichen Fakultät III der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 03.11.2008

Abstract
Aus Nahrungsproteinen freigesetzte Peptide können atheroskleroserelevante Parameter bei Mensch und Tier beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war, aus Nahrungsproteinen abgeleitete Peptide mit definierter Aminosäuresequenz zu finden, die eine Wirkung auf atheroskleroserelevante Parameter von humanen arteriellen Endothelzellen (HAoEC) ausüben.
In einem Screening wurde die Wirkung von 28 Di- und Tripeptiden (1 nM-10 mM) auf die Proliferation von Endothelzellen untersucht. Im nächsten Schritt wurde die Wirkung der Peptide (100 nM-1 mM), die die Endothelzellproliferation signifikant beeinflussten, auf die Freisetzung der vasoaktiven Substanzen NO, PGI2 und TXA2 aus HAoEC untersucht. Die Freisetzung von NO aus aktivierten HAoEC (0,2 ng TNF-α/ml Medium) wurde durch Val-Pro-Leu, Ser-Glu, Leu-Leu-Leu, Ser-Ser-Ser, Glu-Glu-Glu und Glutaminsäure stimuliert, die Freisetzung aus nicht aktivierten HAoEC nur durch Val-Pro-Leu und Glutaminsäure. Die Freisetzung des PGI2 aus aktivierten HAoEC wurde durch Ser-Glu, Val-Pro-Leu, Ser-Ser-Ser, Glu-Glu-Glu und Glutaminsäure stimuliert, die Freisetzung aus nicht aktivierten HAoEC durch Ser-Glu, Glu-Glu, Val-Pro-Leu, Ser-Ser-Ser, Glu-Glu-Glu und Glutaminsäure. Dies kann auf eine erhöhte Transkription der COX-2 unter Peptideinfluss zurückgeführt werden. Die Freisetzung des TXA2 wurde nur in nicht aktivierten HAoEC durch Inkubation mit Leu-Leu-Leu und Glutaminsäure erhöht.
Desweiteren wurden Untersuchungen zur Wirkung der bioaktiven Peptide auf die adhäsiven Eigenschaften der HAoEC durchgeführt. Dazu wurde die Adhäsion von U937-Monozyten an HAoEC und die Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle E-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1 auf HAoEC unter Peptideinfluß (50 ÁM) untersucht. Die Behandlung der HAoEC mit Val-Pro-Leu, Leu-Leu-Leu, Ser-Ser-Ser, Glu-Glu-Glu oder Glutaminsäure inhibierte die TNF-α-induzierte Monozytenadhäsion und die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin. Die Oberflächenexpression von ICAM-1 und VCAM-1 wurde durch die Peptidinkubation kaum beeinflusst. Die TNF-α-induzierte Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB wurde nur durch Ser-Ser-Ser signifikant inhibiert.
Es ist festzustellen, dass bioaktive Peptide ausfindig gemacht wurden, die die Freisetzung vasoaktiver Substanzen und die adhäsiven Eigenschaftenvon HAoEC im Sinne einer Atheroskleroseprävention günstig beeinflussen.

Peptides released from food proteins can influence atherosclerosis-relevant parameters at humans and animals. The aim of this study was to find food protein-derived peptides with defined amino acid sequences which show an impact on atherosclerosis-relevant parameters on endothelial cells of human arteries (HAoEC).
In a screening 28 di- and tripeptides (1 nM - 10 mM) were tested for effecting endothelial cell-proliferation. Next, peptides (100 nM-1 mM), significantly influencing proliferation, were examined for having an effect on the release of vasoactive substances NO, PGI2 and TXA2 by HAoEC. Incubation of activated HAoEC (0.2 ng TNF-α/ml medium) with Val-Pro-Leu, Ser-Glu, Leu-Leu-Leu, Ser-Ser-Ser, Glu-Glu-Glu and glutamic acid stimulated the release of NO, but only incubation with Val-Pro-Leu and glutamic acid stimulated the release of NO from non-activated HAoEC. Incubation of activated HAoEC with Ser-Glu, Val-Pro-Leu, Ser-Ser-Ser, Glu-Glu-Glu and glutamic acid stimulated the release of PGI2, and incubation with Ser-Glu, Glu-Glu, Val-Pro-Leu, Ser-Ser-Ser, Glu-Glu-Glu and glutamic acid stimulated the release of PGI2 of non-activated HAoEC. These effects can be explained by an increased transcription of COX-2 through the peptides. The release of TXA2 was stimulated in non-activated HAoEC only by incubation with Leu-Leu-Leu and glutamic acid.
Furthermore the effects of bioactive peptides on the adhesive properties of HAoEC were examined. Therefore the U937-monocyte-adhesion to HAoEC and the expression of adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin
were determined after incubation with 50 ÁM of bioactive peptides. Treatment of HAoEC with Val-Pro-Leu, Leu-Leu-Leu, Ser-Ser-Ser, Glu-Glu-Glu and glutamic acid inhibited TNF-α-induced monocyte adhesion and the expression of the adhesion molecule E-selectin. Expression of ICAM-1 and VCAM-1 were almost not modulated by peptides. TNF-α-induced activation of NF-κB was significantly inhibited only after treatment with Ser-Ser-Ser.
In conclusion, within the present study bioactive peptides could be identified which influence the release of vasoactive substances and the adhesive properties of HAoEC in a beneficial manner making them less prone to atherosclerosis.

Keywords:
Nahrungsprotein, bioaktive Peptide, Di- und Tripeptide, Endothelzellen, serumfrei, Proliferation, vasoaktive Substanzen, Adhäsionsmoleküle, Monozytenadhäsion, Atherosklerose

dietary protein, bioactive peptides, di- and tripeptides, endothelial cells, serum free, proliferation, vasoactive substances, adhesion molecules, monocyte adhesion, atherosclerosis

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Tabellenverzeichnis, Abbildungsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1, I-VIII)
1 Einleitung und Fragestellung (1-6)
2 Material und Methoden (7-27)
3 Ergebnisse (28-51)
4 Diskussion (52-70)
5 Zusammenfassung (71-73)
6 Summary (74-76)
7 Literaturverzeichnis (77-88)