Ralitza Danova-Alt

Die Wirkung von xenobiotischem Phosphit auf die Phosphatmangelantwort und den Stoffwechsel von Pflanzen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 16.12.2008

Abstract
Phosphit (Phi, H2PO3-), die reduzierte Form von Orthophosphat (Pi, H2PO4-), findet in der Landwirtschaft eine breite Anwendung als Wirkstoff von Fungiziden. Unter Pi-limitierenden Bedingungen kann Phi jedoch die Pflanzenentwicklung stören. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von Phi auf die Pi-Mangelantwort und den Stoffwechsel von Pflanzen zu beschreiben.
Durch morphologische und transkriptionelle Studien an Solanum lycopersicum, Nicotiana tabacum und Arabidopsis thaliana wurde gezeigt, dass Phi in Pi-unterversorgten Zellkulturen und Pflanzen zu einer starken Repression der Pi-Mangelantwort führte. Transportstudien mit BY-2-Tabakzellen zeigten, dass Phi die Pi-Aufnahme in Pi-verarmten Zellen in einem kompetitiven Mechanismus hemmt. Durch in vivo 31P-NMR an BY-2 Zellkulturen konnte die intrazelluläre Akkumulation von Phi in Pflanzenzellen erstmals direkt bewiesen werden. Weiterhin ermöglichten die in vivo NMR-Studien die subzelluläre Anreicherung von Phi und seinen Einfluss auf den Primärstoffwechsel zu verfolgen. Hierbei zeigte sich, dass das Anreicherungsmuster von Phi vom metabolischen Status der Zellen abhängig war: In Piverarmten Zellen akkumulierte Phi vorwiegend im Cytoplasma und kaum in der Vakuole. Piversorgte Zellen akkumulierten Phi dagegen direkt in der Vakuole. Phi konnte trotz ausgeprägter cytoplasmatischer Anreicherung bei Pi-Mangel Pi im Pflanzenstoffwechsel nicht ersetzen. Es war keine messbare Wirkung von Phi auf den Pflanzenstoffwechsel zu detektieren, da der metabolische Zustand und die Energieladung über mehrere Stunden unverändert blieben. Phi-gesättigte Zellen reagierten auf die Zugabe von Pi mit einer raschen Stoffwechselaktivierung in dessen Folge ein schneller Efflux von Phi aus dem Cytoplasma detektiert werden konnte. Eine Stoffwechselschädigung durch Phi konnte somit ausgeschlossen werden. Weiterhin zeigten diese Ergebnisse, dass BY-2 Zellen Phi von Pi diskriminieren konnten. Dies könnte möglicherweise durch einen energieabhängigen Entgiftungsweg für Phi erklärt werden.

Phosphite (Phi, H2PO3-), the reduced form of orthophosphate (Pi, H2PO4-), is broadly used in agriculture as the active compound of fungicides. Nevertheless, under Pi limiting conditions Phi can disturb plant development. The aim of this work was to describe the effects of Phi on the Pi starvation response and the metabolism of plant cells.
Morphological and transcriptional studies on Solanum lycopersicum, Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana confirmed that Phi strongly repressed the Pi starvation response of plant cell cultures and plants. Transport studies on Pi starved tobacco BY-2 cells demonstrated that Phi inhibits the Pi uptake in a competitive manner. In vivo 31P-NMR gave for the first time direct evidence for the intracellular accumulation of Phi in BY-2 plant cells. Furthermore, the in vivo NMR studies allowed following the subcellular distribution of Phi and its effects on plant metabolism. The distribution pattern of Phi depended on the metabolic state of the cells: Pi-deprived cells accumulated Phi predominantly in the cytoplasm, but barely in the vacuolar compartment. In contrast, Pi-preloaded cells accumulated Phi directly into vacuoles. In spite of its distinct cytoplasmic accumulation under Pi deprivation conditions, Phi could not substitute for Pi in plant metabolism. During perfusion with Phi, cell metabolism and energy charge remained unchanged. On the resuply of Pi to Phi perfused cells, Phi was rapidly and selectively exported from the cytoplasm, demonstrating that the BY-2 cells were able to discriminate between Pi and Phi. It appears likely, that the observed exudation of Phi is due to an energy dependent detoxification of Phi.

Keywords:
Phosphit, Phosphat, Phosphatmangel, in vivo 31P-NMR, kompetitive Hemmmechanismus, Pflanzenstoffwechsel, BY-2-Tabakzellen, Solanum lycopersicum

Phosphite, phosphate, phosphate starvation, in vivo 31P-NMR, competitive inhibition, plant metabolism, tobacco BY-2 cells, Solanum lycopersicum

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (2, i-vii)
1 Einleitung (1-24)
2 Material und Methoden (25-52)
3 Ergebnisse (53-99)
4 Diskussion (100-123)
5 Zusammenfassung (124-126)
6 Literaturverzeichnis (127-142)
7 Anhang (I-XV)
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