Daniela Sigrid Floß

Untersuchungen zur Funktion der mykorrhizainduzierten Apocarotinoide in Wurzeln von Medicago truncatula

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 15.12.2008

Abstract
In der vorliegenden Arbeit wurde die mykorrhizainduzierte Akkumulation von C13-Cyclohexenon- und C14-Mycorradicinderivaten in kolonisierten Wurzeln untersucht, um deren funktionelle Bedeutung für die arbuskuläre Mykorrhiza (AM) zu klären. Bisherige Studien ließen vermuten, dass diese Verbindungen durch die symmetrische Spaltung eines C40-Carotinoids entstehen, dessen Vorstufen aus dem plastidären Methylerythritolphosphat (MEP)-Weg hervorgehen. Ein Isogen des MEP-Wegs, 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase2 (DXS2), dessen Expression mit der C13- und C14-Apocarotinoidakkumulation korreliert, stellte den Ausgangspunkt der Arbeit dar.
In der Interaktion von Medicago truncatula und dem AM-Pilz Glomus intraradices konnte Aktivität der Promotorregion von MtDXS2 hauptsächlich in Cortexzellen, die einen Arbuskel beherbergen, detektiert werden. Durch die starke Reduktion der C13- und C14-Apocarotinoidgehalte bei einem transgenen RNAi-Ansatz in hairy roots wurde nachgewiesen, dass die Biosynthese dieser Verbindungen über den DXS2-abhängigen MEPWeg verläuft. Auswirkungen der reduzierten Apocarotinoidakkumulation auf den Mykorrhizierungsgrad und die Arbuskelabundanz wurden nicht festgestellt. In RNAi-Wurzeln mit stark reduzierten MtDXS2-Transkriptmengen wurde aber ein drastischer Abfall der Transkriptakkumulation von typischen AM-Markergenen gezeigt. Ferner konnte ein vermehrtes Auftreten von degenerierenden Arbuskeln beobachtet werden.
Um zu klären, ob die reduzierten Cyclohexenon- und Mycorradicinderivatgehalte die Ursache dieser Veränderungen sind, wurde ein transgener RNAi-Ansatz für einen späteren Syntheseschritt durchgeführt. Als Zielgen wurde das Gen für eine carotinoidspaltende Dioxygenase (CCD1) gewählt. Die Suppression von MtCCD1 in mykorrhizierten Wurzeln führte zu einer drastischen Reduktion der Mycorradicingehalte aber lediglich zu einer etwa 50-prozentigen Abnahme der Cyclohexenonderivatgehalte. Weiterhin wurde die Akkumulation von C27-Apocarotinoidverbindungen nachgewiesen, die zu einer Gelborangefärbung der Wurzeln führte. Diese Ergebnisse deuten an, dass die Biosynthese der Mycorradicin- und Cyclohexenonderivate über eine konsekutive, zweistufige, durch Kompartimentierung getrennte Spaltung des C40-Vorläufercarotinoids erfolgt. Veränderungen in der Transkriptakkumulation von AM-Markergenen wurden in MtCCD1-RNAi-Wurzeln nicht nachgewiesen, wohingegen auch ein vermehrtes Auftreten degenerierender Arbuskel festgestellt werden konnte.
Aufgrund dieser Ergebnisse wird eine Rolle der C13- und C14-Apocarotinoide in einem pflanzengesteuerten Arbuskelabbau vorgeschlagen.

The work described here deals with the investigation of the mycorrhiza-induced accumulation of C13 cyclohexenone and C14 mycorradicin derivatives in colonized roots for elucidation of their functional significance in the arbuscular mycorrhiza (AM). The compounds are thought to be produced by symmetrical oxidative cleavage of a plant C40 carotenoid. The precursors for carotenoid biosynthesis are produced by the plastidial methylerythritol phosphate (MEP) pathway. The starting point of the work was a particular isogene of the MEP pathway, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase2 (DXS2), whose expression correlates with the accumulation of C13 and C14 apocarotenoids.
Upon colonization of Medicago truncatula roots with the AM-fungus Glomus intraradices promoter activity of MtDXS2 was mainly detected in arbusculated cortex cells. The strong reduction of apocarotenoid levels via a transgenic RNAi approach in hairy roots revealed that these compounds are produced via the DXS2-dependent MEP pathway. No effects on mycorrhization degree and arbuscule abundance due to the decreased apocarotenoid levels were found. However, in RNAi roots with strongly reduced MtDXS2 transcript levels a drastic decrease in the transcript levels of normally AM-induced marker genes was shown. Furthermore, an increase in the relative number of degenerating arbuscules has been observed.
In order to clarify whether the results observed are caused by the reduced mycorradicin and cyclohexenone levels, an RNAi approach was initiated targeting a gene for a carotenoid cleavage dioxygenase (CCD1) catalyzing a late step of biosynthesis. The suppression of MtCCD1 led to a strong decrease in the levels of mycorradicin, but to an only moderate reduction of cyclohexenone derivatives to approximately 50%. Furthermore, the accumulation of C27 apocarotenoids could be shown, which leads to a yellow-orange coloration of the roots. These results suggest that mycorradicin and cyclohexenone derivatives are produced by a consecutive two-step C40 carotenoid cleavage, which is localized in different compartments of the cell. The analysis of the MtCCD1 RNAi roots did not show significant alterations in the transcript levels of normally AM-induced marker genes albeit an increase in degenerating arbuscules was observed similar to the results obtained by MtDXS2 repression.
Based on these results a role of C13 and C14 apocarotenoids in a plant-controlled arbuscule degradation process is proposed.

Keywords:
arbuskuläre Mykorrhiza (AM), Methylerythritolphosphat (MEP)-Weg, Apocarotinoide, RNAi, Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Wurzeltransformation, Microarray, Medicago truncatula, Glomus intraradices, 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase2 (DXS2), carotinoidspaltende Dioxygenase1 (CCD1)

arbuscular mycorrhiza (AM), methylerythritol phosphate (MEP) pathway, apocarotenoids, RNAi, Agrobacterium rhizogenes-mediated root transformation, microarray, Medicago truncatula, Glomus intraradices, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase2 (DXS2), carotenoid cleavage dioxygenase1 (CCD1)

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis, Tabellen & Abbildungen
I Einleitung (1-15)
II Material und Methoden (16-36)
III Ergebnisse (37-82)
IV Diskussion (83-101)
V Zusammenfassung/Summary (102-105)
VI Literatur (106-116)
VII Anhang (1, A1-A13)
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