Stefan Frielingsdorf

Funktionelle Charakterisierung von Teilschritten des Tat-abhängigen Proteintransports an der Thylakoidmembran

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 12.12.2008

Abstract
Bislang konnten vier Wege identifiziert werden, auf denen ein Protein in die chloroplastidäre Thylakoidmembran integriert bzw. über diese Membran transportiert werden kann. Einer dieser Wege ist der sogenannte Tat-Weg (twin-arginine translocation). Dieser Transportweg, der auch in der Cytoplasmamembran von Bakterien und Archaeen gefunden wird, zeichnet sich insbesondere durch die Fähigkeit aus, Proteine in vollständig gefalteter Konformation über eine Membran, welche einen Protonengradienten aufrechterhält, transportieren zu können. Gleichzeitig ist der Transport energetisch unabhängig von Nukleosidtriphosphaten wie ATP und benötigt lediglich einen Protonengradienten (DpH) bzw. einen elektrochemischen Gradienten (DY), der an der Membran anliegt. Vermittelt wird der Transport durch Signalpeptide, die sich am N-Terminus des zu transportierenden Proteins befinden und ein sogenanntes Zwillingsarginin-Motiv (engl. twin-arginine motif) enthalten. Da dieses Motiv in den entsprechenden Signalpeptiden sehr stark konserviert ist, trug es auch zur Benennung des Transportwegs bei. Nach Abschluss des Transports werden die Signalpeptide im Allgemeinen durch eine Prozessierungspeptidase abgespalten. Bis heute wurden drei Proteine gefunden, die für den Tat-abhängigen Transport an der Thylakoidmembran essentiell sind und als TatA, TatB und TatC bezeichnet werden.
Da der Tat-Weg in der Lage ist gefaltete Proteine zu transportieren, ist davon auszugehen, dass die Translokation mechanistisch gesehen grundlegend anders ablaufen muss als z.B. der Transport über den Sec-Weg, welcher Proteine ausschließlich in ungefalteter Form transportiert. Daher lag der Fokus der vorliegenden Arbeit vorwiegend auf der genaueren Charakterisierung von Teilschritten des Tat-abhängigen Proteintransports, mit dem Ziel die Aufklärung des zu Grunde liegenden Mechanismus voranzutreiben. Die Analyse von Einzelschritten des Tat-Wegs wurde durch den Einsatz eines bestimmten chimären Transportsubstrats, dem sogenannten 16/23-Protein, ermöglicht. Der Transport dieses Proteins über den Tat-Weg ist derart verlangsamt, dass zwei Translokationsintermediate detektiert werden können. Durch die Verwendung des 16/23-Proteins ist es also jederzeit möglich zu verfolgen, inwiefern sich Veränderungen am Transportsystem auf den Fortgang des Transportprozesses auswirken.
So wurde im ersten Teil der Arbeit festgestellt, dass die Proteine der Translokase für die Initiation des Transportvorgangs nicht essentiell sind. Stattdessen muss lediglich eine Membran vorhanden sein, damit das erste Translokationsintermediat ausgebildet werden kann. Im zweiten Teil der Arbeit stellte sich heraus, dass das Protein TatA in hochmolekularen Komplexen in löslicher Form im Stroma von Chloroplasten vorkommt. Bislang wurde es aber hauptsächlich als membranständiger Teil der Tat-Translokase beschrieben. Die lösliche Form ist, wie es zuvor für die membranständige Form beschrieben wurde, in der Lage den eigentlichen Translokationsschritt, in dem der reife Teil des Transportsubstrats über die Membran transportiert wird, zu vermitteln. Im letzten Teil der Arbeit wurde nach der besonderen Eigenschaft gesucht, die zur Verlangsamung des Transportprozesses des 16/23-Proteins führt. Dabei zeigte sich, dass eine Erhöhung der Hydrophobizität im Bereich der Prozessierungsstelle zu einer verlängerten Bindung an einen Komplex aus den Proteinen TatB und TatC führt. Dies hat wiederum insgesamt eine Verlangsamung des Transportprozesses zur Folge. Des Weiteren stellte sich heraus, dass die Dissoziation des Transportsubstrats von dem genannten Komplex aus TatB und TatC auch eine Voraussetzung für die finale Prozessierung zum reifen Protein und somit für den Abschluss des Transportprozesses darstellt.

To date four protein transport pathways have been identified at the thylakoid membrane of chloroplasts. One of these pathways, which also operates at the cytoplasmic membranes of bacteria and archaea, is referred to as Tat pathway (twin-arginine translocation) and mediates the transport of folded proteins across energised membranes. The Tat pathway acts independent from nucleoside triphosphates like ATP but depends on a proton gradient (DpH) or electric potential (DY) across the membrane, respectively. The transport of passenger proteins is mediated by N-terminal extensions, the so-called signal peptides, which carry a highly conserved twin-arginine motif. This motif in turn led to the term twin-arginine translocation (Tat). Upon completion of the transport process signal peptides are generally removed by a corresponding signal peptidase. To date three proteins, namely TatA, TatB, and TatC, have been identified to be essential for Tat-dependent protein translocation in the plant system.
Since the Tat pathway is capable of transporting folded proteins a mechanism can be assumed differing from other pathways like the Sec pathway, which exclusively transports proteins in an unfolded conformation. Therefore, the present study focussed primarily on the characterisation of distinct steps of the translocation process aiming for the elucidation of the underlying mechanism. Analysis of single steps of the transport process was facilitated by using a chimeric protein referred to as 16/23 protein. Tat-dependent translocation of this protein is drastically slowed down so that two translocation intermediates can be detected. Thus, any manipulation of the transport system can be traced back to a certain step of the transport process.
In the first part of the present study this system revealed that proteins of the Tat translocase are dispensable for the initiation of the transport process. Instead, the presence of a membrane is sufficient for the formation of the first translocation intermediate. In the second part the protein TatA was found to be present in high molecular weight complexes within the chloroplast stroma. So far TatA was assumed to be an integral membrane component of the Tat translocase exclusively located within the thylakoid membrane. Soluble TatA is able to mediate the translocation step in particular, like it was previously described for membrane-integral TatA. The last part of the present study concentrated on the special feature of the 16/23 protein which leads to its slowed transport. It turned out that an increase in hydrophobicity within the processing site of the precursor protein leads to prolonged association with a complex composed of the proteins TatB and TatC leading to a retardation of the transport process. In addition, dissociation of the precursor protein from the above mentioned complex is a prerequisite for terminal processing of the precursor protein to its mature form.

Keywords:
Tat, twin-arginine translocation, Proteintransport, Thylakoid, Chloroplast, Membran, Translokationsintermediat

Tat, twin-arginine translocation, protein transport, thylakoid, chloroplast, membrane, translocation intermediate

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Summary, Zusammenfassung, Inhaltsverzeichnis, Abbildungsverzeichnis (I-IX)
1 Einleitung (1-13)
2 Ergebnisse (14-61)
3 Diskussion (62-74)
4 Literaturverzeichnis (75-84)
5 Anhang (85-87)