Hagen Hofmann

Initiale Schritte der Faltung und Entfaltung von Barstar aus Bacillus amyloliquefaciens

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 16.07.2008

Abstract
Die vorliegende Arbeit hatte die Beantwortung von zwei Fragestellungen zum Ziel. Zum einen sollte die in entfalteten Polypeptidketten dominierenden physikalischen Kräfte mittels Einzelmolekülspektroskopie identifiziert werden. Zum anderen sollte mittels NMR-gekoppelten Amidprotonen-Austausch versucht werden, strukturelle und energetische Informationen über die, während der Entfaltung eines Proteins auftretenden Intermediate zu gewinnen. Einzelmolekülspektroskopische Untersuchungen des entfalteten Zustandes des Modellproteins Barstar zeigten, dass der Gyrationsradius (Rg) der entfalteten Polypeptidkette von Barstar mit sinkender Denaturierungsmittelkonzentration abnimmt. Ein Vergleich von Rg zwischen den beiden Denaturierungsmitteln Harnstoff und Guanidiniumchlorid (GdmCl) zeigte allerdings, dass dieser Kollaps der Polypeptidkette vom Denaturierungsmittel abhängt. So wird in geringen Konzentrationen an GdmCl ein geringerer Gyrationsradius des entfalteten Proteins gefunden als in Harnstoff. Dieser Unterschied konnte auf den Ladungszustand der Polypeptidkette zurückgeführt werden und zeigt, dass die Größe des entfalteten Zustandes von der Nettoladung und damit von der innerhalb der Kette wirkenden Coulomb-Energie abhängt. Weiterhin konnte ein Einblick in die Energielandschaft der Entfaltung von Barstar gewonnen werden. So konnte durch eine Kombination aus Fluoreszenz-basierten stopped-flow-Experimenten und schnellem NMR-gekoppelten Amidprotonenaustausch gezeigt werden, dass die Entfaltung von Barstar über ein Intermediat mit unstrukturierter Helix 3 verläuft. Aus den Amidprotonenaustausch-Experimenten konnte weiterhin geschlossen werden, dass dieses Intermediat um 8 kJ mol-1 gegenüber dem nativem Zustand destabilisiert ist.

By using the method of single molecule spectroscopy, the unfolded state of our model protein barstar could be investigated even in the presence of native molecules. The approach allowed an analysis of the physical forces acting in unfolded proteins under native-like conditions. By decreasing the concentrations of additives like urea and guanidinium chloride (GdmCl) the size of the unfolded state decreases, a process which is also known as collapse. Unexpectedly, a smaller radius of gyration (Rg) of the unfolded polypeptide chain was found in low GdmCl-concentrations than in urea. The discrepancy between Rg in both denaturants could be explainded by Coulomb-forces in the unfolded state. Whereas the salt GdmCl screens the intrinsic charges in the polypeptide chain thereby allowing a collaps to higher densities, electrostatic repulsions inhibit this contraction in the neutral dentaturant urea. The results indicate that electrostatic long-range interactions determine the size of the unfolded state under native conditions. In addition, an unfolding intermediate of barstar could be identified using fluorescence-stopped flow measurements. Moreover, fast amide proton exchange experiments indicated that helix 3 of barstar is unstructured in this partially folded intermediate which is by 8 kJ mol-1 destabilized compared to the native-state.

Keywords:
Proteinfaltung, Einzelmolekülspektroskopie, Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET), NMR-Spektroskopie, Protonenaustausch

protein folding, single molecule spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer (FRET), NMR-spectroscopy, proton exchange

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Abkürzungen und Symbole, Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung (1-2)
2. Theorie (3-34)
3. Material und Methoden (35-51)
4. Ergebnisse und Diskussion (52-91)
5. Zusammenfassung (92-94)
6. Literaturverzeichnis (95-106)
7. Anhang (107-113)
8. Publikationen, Poster und Tagungsbeiträge (114-115)