Uta Demus

Entwicklungs- und jasmonatabhängiges Vorkommen eines 23 kDa Proteins der Gerste (Hordeum vulgare L. cv. Salome)

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 17.11.1999

Abstract
Bisherige Untersuchungen zur Expression der Gene jasmonatinduzierbarer Proteine (JIPs) der Gerste bezogen sich ausschließlich auf die Induzierbarkeit durch exogen appliziertes Jasmonat bzw. ABA oder durch äußere Streßeinwirkungen wie etwa Trockenstreß und osmotischer Streß. Eine Rolle von Jasmonaten auf Wachstums- und Entwicklungsprozesse konnte nur phänotypisch/physiologisch beobachtet werden. Eine molekulare Analyse der Jasmonatwirkung in der Entwicklung der Gerste wurde deshalb eine notwendige Aufgabe. Diesem Problem widmet sich die vorliegende Arbeit unter Nutzung von JIP23 (jasmonatinduzierbares Protein der Größe von 23 kDa) als Reporterprotein.
Die gewählte Strategie beinhaltet die Analyse der jip-Expression in der Gerstenentwicklung mittels Northern-Hybridisierung und immunologisch an Westernblots bzw. durch in situ-Hybridisierung und immunzytologisch an Geweben. Das Expressionsmuster des Reportergens konnte so zeitlich und örtlich verfolgt werden. Die Daten dokumentieren, daß eine jip23-Expression im Verlauf des Reifungsprozesses von Gerstensamen des Kultivars Salome stattfindet, im vollständig ausgereiften, trockenen Samen Transkript und Protein aber nicht mehr nachweisbar sind. Im wachsenden Keimling wurde eine gewebs- und zellspezifische jip23-Expression gefunden. JIP23 und seine mRNA konnten in den Geleitzellen des vaskulären Systems, vor allem im Mesokotyl, und allen Zellen des Scutellums nachgewiesen werden. Es konnte eine zeitliche und örtliche Änderung der jip23-Expression während der Keimlingsentwicklung gezeigt werden.
Da sich über Sequenzvergleiche in Datenbanken für JIP23 keine Funktionshinweise ergaben, wurden durch Kartierung einer zeitlich und räumlich spezifischen Expression und der Analyse der Kompartimentierung der Isoformen dieses Proteins Funktionshinweise abgeleitet. Dazu wurden neben den bereits erwähnten Methoden die Methoden der Zellkernisolation, der Proteinextraktion, der ein- und zweidimensionalen elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen verwendet.
In Anbetracht der geringen Unterschiede ihres Auftretens ist ein ausgeprägter funktioneller Unterschied der Isoformen von JIP23 im Keimling und im jasmonat-behandelten Blatt unwahrscheinlich. Ein verstärktes Vorkommen einiger Isoformen von JIP23 im Zellkern jasmonat-behandelter Blätter konnte gezeigt werden. Vermutet wird eine unterschiedliche Funktion der Isoformen in den Zellkompartimenten.
Für JIP23 werden zwei Funktionen diskutiert. Aufgrund des Vorkommens in Geweben, die dem Transport osmotisch wirksamer Nährstoffe aus dem Endosperm in den Keimling dienen (Scutellum und das vaskuläre System), könnte JIP23 eine Schutzfunktion bei osmotischem Streß ausüben. Darüberhinaus könnte JIP23 die Ausprägung des Photosyntheseapparates stören: Es akkumuliert in photosynthetisch inaktiven Geweben.
Es konnte gezeigt werden, daß die entwicklungsabhängige jip23-Expression in Getreiden nicht sorten- bzw. artspezifisch ist. Obwohl Blätter des Gerstenkultivars Gerbel nach Jasmonat-Behandlung nicht wie Blätter des Gerstenkultivars Salome mit einer jip23-Expression reagieren, konnte gezeigt werden, daß das Gerbelgenom jedoch mindestens ein Gen für JIP23 besitzt und dieses während der Keimung exprimiert wird. Darüber hinaus läßt das Vorkommen von mindestens zwei Genen für JIP23 im Genom des Gerstenkultivars Salome und der jasmonatunabhängigen jip23-Expression in der Gerbel eine unterschiedliche Induzierbarkeit dieser Gene im JM-behandelten Blatt und im Keimling vermuten.
Da jip23 im Gerstenblatt jasmonatabhängig exprimiert wird, wurde analysiert, ob auch im Keimling ein endogener Jasmonatanstieg die JIP23-Synthese auslöst. Die gleichzeitige Analyse von jip23-Expression und Bestimmung der endogenen Jasmonatgehalte ergab aber keine eindeutige Korrelation. Diskutiert wird eine jasmonatunabhängige bzw. nicht allein jasmonatabhängige Induktion der Gene für JIP23 im Keimling.

Previous investigations of the expression of JIP genes (jasmonate-induced protein) from barley were related only to the induction upon exogenous application of jasmonate or abscisic acid or the influence of environmental stresses e.g. desiccation or osmotic stress. A phenotypic/physiological role of jasmonates in plant growth and development was observed for several times without a molecular explanation. The molecular analysis of the effect of jasmonates in the development of barley is the item of this work. JIP23 (jasmonate-induced protein, 23 kDa) was used as a reporter.
Jip expression in the development of barley was analysed by Northern blots, Western blots and by in situ hybridization and immunocytochemically at tissue sections. During seed development a jip23 expression was found, but in dry seeds transcript and protein were no longer detectable. In growing seedlings was found a tissue- and cell type-specific jip23 expression. Transcript and protein were detectable in companion cells of the phloem, above all in the mesokotyl, and in all cells of the scutellum. A time and local change of the jip23 expression during seedling development has been shown.
No indications of function for JIP23 could be drawn from sequence comparisons in the data bases previously. Therefore the analysis of time and local specific expression and analysis of compartmentation of the isoforms of JIP23 was done in order to derive indications of function for this protein. For that purpose additional methods (isolation of cell nuclei, extraction of proteins, 1- and 2-dimensional separations of proteins) were used.
There are only insignificant differences between the isoforms of JIP23 in seedlings and in jasmonate-treated leaves. Therefore a marked functional difference of the isoforms in seedlings or jasmonate-treated leaves is improbable. An increased occurence of several isoforms in the nucleus of jasmonate-treated leaves suggests, that the isoforms might have different functions within the compartments of the cell.
Two functions will be discussed for JIP23. The occurence in tissues, which serve for the transport of osmotically active nutrients from endosperm to seedling (scutellum, phloem) suggests, that JIP23 might have a protective function during osmotic stress. Beyond that JIP23 might interfere with the accumulation of the photosynthetic apparatus, because it accumulates in tissues which are photosynthetic inactive.
It was shown, that jip23 expression during development in cereals is not cultivar- or species-specific. Jip23 expression takes place in jasmonate-treated leaves from cultivar "Salome" but not in leaves from cultivar "Gerbel". In the genome from cultivar "Gerbel" a gene which codes for JIP23 was detected and is expressed during seedling development. Besides this the occurence of at least two genes for JIP23 in the genome of cultivar "Salome" suggests, that JIP23 genes might be induced differentially in jasmonate-treated leaves and seedlings.
In barley leaves the jip23 expression is dependent on jasmonates. Therefore it was investigated, if in seedlings a endogenous increase of jasmonates can induce the synthesis of JIP23. No clear correlation was found between the accumulation of JIP23-transcript and the contents of jasmonates. Under disdussion is the induction of the JIP23 genes in the seedling, independent on jasmonate or not alone dependent on jasmonate.

Keywords:
Hordeum vulgare L., Entwicklung, Keimung, endogener Jasmonatgehalt, JIP23 (jasmonatinduziertes Protein, 23 kDa), Isoformen, in situ Hybridisierung, Immunfluoreszenzanalyse, JIP23-Gene

Hordeum vulgare L., development, germination, endogenous jasmonate content, JIP23 (jasmonate-induced protein, 23 kDa), isoforms, in situ hybridization, immunofluorescence analysis, JIP23 genes

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung (1-14)
2. Material und Methoden (15-32)
3. Ergebnisse (33-66)
4. Diskussion (67-85)
5. Zusammenfassung (86-88)
6. Literaturverzeichnis (89-102)