Alexander Bucka

Charakterisierung kleiner cytoplasmatischer Hitzeschockproteine der Wildtomate (Lycopersicon peruvianum L.)

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 30.04.1999

Abstract
Alle Organismen, die hohen, aber nicht letalen Temperaturen ausgesetzt sind, reagieren mit der Expression einer bestimmten Gruppe von Proteinen, der sogenannten Hitzeschockproteine (HSP). Neben dem klassischen Hitzeschock führen auch eine Reihe anderer Streßsituationen (Schwermetallexposition) zur Expression einzelner oder mehrerer Hitzeschockproteine. Die kleinen, cytoplasmatischen Hitzeschockproteine sind eine besonders prominente Gruppe, deren Charakterisierung im Mittelpunkt dieser Arbeit stand.
Das Genom der Wildtomate enthält mindestens sechs Gene, die für kleine, cytoplasmatische Hitzeschockproteine kodieren. Das Screening einer Expressions-cDNA Bank der Wildtomate ergab eine Reihe positiver Klone, von denen vier vollständig sequenziert wurden. Die abgeleiteten Proteinsequenzen zeigen, daß es sich um Vertreter der Klasse I der cytoplasmatischen Low Molecular Weight (LMW) Hitzeschockproteine mit isoelektrischen Punkten von 5,2 bis 6,3 handelt, die eine hohe Homologie zu Proteinen der gleichen Familie in anderen Pflanzen aufweisen.
Eine der cDNAs (Klon 92) wurde für die Expression als GST- und His6-Fusionsprotein in Escherichia coli benutzt. Das rekombinante HSP17 zeigte in den verwendeten Blot-Overlay- und GST-Pull-Down-Assays keine spezifischen Wechselwirkungen mit Speicherglobulinen aus Tabak und Leguminosen beziehungsweise RNA, obwohl deren Kolokalisation in vivo gezeigt werden konnte.
Die durchgeführten Chaperon-Assays sind ein Argument für eine Bindung an andere Proteine: das rekombinante HSP17 ist in der Lage, in vitro Citrat Synthase vor einer Aggregation und vor einer thermischen Inaktivierung zu schützen. Es ist aber allein nicht ausreichend, das chemisch denaturierte Enzym wieder korrekt zu falten.
Nach einem Hitzeschock läßt sich HSP17 als Multimer aus 12 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von circa 200 kDa isolieren. In Tomatenzellen bilden sich nach Hitze- beziehungsweise Schwermetalleinwirkung große cytoplasmatische Komplexe, sogenannte Hitzeschockgranula, die zu einem großen Teil aus HSP17 bestehen. Obwohl äußerlich ähnlich, sind sie funktionell verschieden. Während die Granula im Falle eines Hitzeschockes mRNA speichern, konnte hier gezeigt werden, daß sie bei Schwermetallstreß keine RNA enthalten. Auffällig waren auch Unterschiede in der Recovery-Phase: in hitzegestreßten Zellen bilden sich rauhes ER und Golgiapparate in der Nähe der aufgelockerten Granula, während in schwermetallexponierten Zellen nur eine Auflösung der Granula zu beobachten ist.
Hitzestreß hat dramatische Auswirkungen auf Struktur und Funktion des Nukleolus. Im Gegensatz dazu bewirken Schwermetalle keine strukturellen Veränderungen oder Auflockerungen des Nukleolus.
Die Synthese der Haushaltsproteine ist bei Schwermetallexposition, im Unterschied zum Hitzeschock, kaum eingeschränkt.
Trotz der strukturellen Homologie bestehen funktionelle Unterschiede zwischen den nach Hitze- beziehungsweise Schwermetallstreß gebildeten Hitzeschockgranula. Eine Speicherung von mRNA ist unter Schwermetallstreß ohne Bedeutung für die Zelle, unter Hitzeschock möglicherweise eine Notwendigkeit für ihr Überleben. Die unter Schwermetallstreß gebildeten Granula könnten dem Schutz und/oder der Rückfaltung denaturierter Proteine dienen. Das Vorkommen weiterer HSPs (zum Beispiel HSP70) und anderer bisher nicht identifizierter Proteine, die möglicherweise für eine korrekte Faltung denaturierter ‘Substrate’ notwendig sind, macht eine Funktion der Granula als Faltungsmaschinerie wahrscheinlich.
Erste Untersuchungen zur Signaltransduktion in den beiden Streßsituation legen nahe, daß bei Hitzestreß ATPasen und Ionenkanäle (oder die durch ATPasen bewirkten Ionenflüsse) an der Übertragung des Signals Hitze beteiligt sind. Offenbar erfolgt die Rezeption des Signals an der Plasmamembran.

All organisms subjected to high, but not lethal temperatures, respond wit the expression of a certain subset of proteins which have been termed heat shock proteins. Some of these proteins are also synthesized in response to other stress situations, e.g. to heavy metal exposure. The investigation of cytosolic Low Molecular Weight Heat Shock Proteins, which are a very prominent family in plants, has been the focus of this work.
The genome of the Wild Tomato, Lycopersicon peruvianum L., contains at least six genes encoding LMW HSPs. The screening of an expression cDNA-library resulted in the isolation of a large number of positive clones, of which four had been fully sequenced. The deduced proteins with isoelectric points between 5,2 and 6,3 all belong to the class I of cytosolic Low Molecular Weight Heat Shock Proteins.
One of the cDNAs had been chosen for the expression of the protein in Escherichia coli both as a GST-fusion protein and as a hexahistidine-tagged recombinant protein. In vitro neither Blot-Overlay- nor GST-Pull-Down-Assays were able to detect any specific interactions with seed storage proteins or RNA, respectively, although it has been shown that they are co-localized in vivo.
Chaperone assays using Citrate Synthase as a substrate demonstrated that recombinant HSP17 is able to protect the enzyme from aggregation and thermal inactivation. Its presence is not sufficient to facilitate the refolding of a chemically denatured protein.
After heat shock HSP17 can be isolated as a multimer consisting of 12 subunits with an approximate molecular weight of 200 kDa. In tomato cell cultures in stress situations large cytoplasmatic complexes, so-called heat shock granules are formed. Whereas in the case of heat stress they had been shown to contain RNA it was demonstrated here that heat shock granules formed after exposure to heavy metals do not contain RNA. Striking differences during the recovery were observed: in heat stressed plant cells rER and Golgi apparatus were formed in the vicinity of the dispersing granules, while in heavy metal exposed cells only the disaggregation of the granules was visible.
Heat stress has a dramatic effect on structure and function of the nucleolus. In contrast to that heavy metals do not cause any structural changes or dispersions of the nucleoli.
Contrary to heat shock, the synthesis of the so-called house-keeping proteins is not inhibited by the presence of heavy metals.
Despite the structural homology of the heat shock granules formed both after heat stress and heavy metal exposure there are obviously functional differences. The storage of mRNA is of no importance during heavy metal stress, whereas it might be a prerequisite for survival during heat shock. The granules formed during heavy metal exposure could be involved in the protection and/or the refolding of denatured proteins. The appearance of additional HSPs (e. g. HSP70) and other, yet unidentified proteins, which are possibly required for a correct folding of denatured ‘substrates’, makes a function as folding machine likely.
The initial investigation of signal transduction elements in both stress situations suggest that during heat shock ATPases and ion channels (or the ion fluxes caused by ATPases) are involved in the transmission of the signal heat. Most likely the perception of the signal takes place at the plasma membrane.

Keywords:
Hitzeschockprotein, HSP, kleine HSP, Tomate, Schwermetallstress, Chaperon, Citrat Synthase. Ultrastruktur, EM, Hitzeschockgranula, Signaltransduktion

heat shock protein, HSP, LMW HSP, tomato, heavy metal stress, chaperone, Citrat Synthase, ultrastructure, EM, heat shock granules, signal transduction

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnisse
1 Einleitung (1-16)
2 Material und Methoden (17-46)
3 Ergebnisse (47-79)
4 Diskussion (80-88)
5 Zusammenfassung (89-90)
6 Literatur (91-108)