Matthias Brandsch, Dr. rer. nat.

Transport von Aminosäuren und Peptiden an Epithelzellen:
Untersuchungen zu Mechanismus, Spezifität und Regulation

Kumulative Habilitationsschrift zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium habilitatus (Dr. rer. nat. habil.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Beschlußdatum 13.06.2000

Abstract
Problemstellung: Epithelzellen von vielzelligen Tieren verfügen über verschiedene Mechanismen zur Translokation von Substanzen. Die Schwerpunkte der 13 Originalarbeiten dieser Habilitationsschrift liegen auf (i) der Charakterisierung des Transportes von Taurin, Leucin und Dipeptiden an kultivierten Epithelzellen von Darm, Niere und Plazenta, (ii) der Aufklärung von strukturellen Erfordernissen, die an Substrate zu stellen sind und (iii) der Identifizierung extra- und intrazellulärer Signale für die Regulation der Transportsysteme.
Methoden: Die Mehrzahl der in dieser Arbeit zusammengefassten Experimente erfolgte an permanent kultivierten Epithelzellen. Ein breites Spektrum an biochemischen und zellphysiologischen Methoden wurde zur Beantwortung der interessierenden Fragen eingesetzt.
Wesentliche Ergebnisse:

  • Die Darmzellen HT-29 und Caco-2 exprimieren den sekundär aktiven Na+/Cl-/Taurin-Symporter. Der Taurintransport wird durch die Protein-Kinasen A und C reguliert. Guanylin, das hitze-stabile E. coli-Enterotoxin und Cholera-Toxin sind physiologische bzw. pathophysiologische Signale für die Regulation des intestinalen Taurintransportes.
  • Die Plazentazellen JAR exprimieren den passiven Leucin-Transporter (System L). Die pH-Sensitivität des Systems wird durch Calmodulin-abhängige Prozesse moduliert.
  • Die Darmzellen Caco-2 und die Nierenzellen MDCK exprimieren den tertiär aktiven "low-affinity, high-capacity" H+/Peptid-Symporter PEPT1. Die Nierenzellen SKPT-0193 exprimieren den tertiär aktiven "high-affinity, low-capacity" H+/Peptid-Symporter PEPT2.
  • Der intestinale Peptidtransport wird durch die Protein-Kinasen A und C posttranslational reguliert. Cholera-Toxin und das hitze-labile E. coli Enterotoxin sind pathophysiologische Signale für die Regulation des intestinalen Peptidtransportes.
  • PEPT1 transportiert Aminosäureamide in Abhängigkeit sterischer, elektronischer und hydrophober Parameter der Amidstruktur.
  • Die transepithelialen Fluxe von ß-Lactam-Antibiotika an Caco-2-Zell-Monolayern und ihre Affinitätskonstanten an PEPT1 sind signifikant korreliert. Der Transport durch PEPT1 stellt den wichtigsten Mechanismus zur Resorption oral verfügbarer ß-Lactam-Antibiotika dar.
  • PEPT1 weist Konformations-Spezifität auf. Das System erkennt und transportiert Xaa-Pro Dipeptide nur in deren trans-Konformation.
    • Schlußfolgerung: Die in der vorgelegten Arbeit an Zellen charakterisierten Transportsysteme arbeiten mit sehr verschiedenen Mechanismen. Die Transporter sind substratspezifisch, oft Epithelgewebe-spezifisch, und sie sind in den Zellmembranen asymmetrisch verteilt. Durch ein solches Arrangement sind Epithelien in der Lage, Stoffaustausch qualitativ, quantitativ und ortsgerichtet zu kontrollieren. Ihre Zellen verfügen außerdem über komplexe Mechanismen zur Feinregulation der Transportprozesse entsprechend den externen und internen Bedingungen. Die Epithelzellen empfangen, transduzieren und amplifizieren dafür extrazelluläre Signale.

    Purpose: Epithelial cells of multicellular organisms express multiple mechanisms for solute translocation across the cell membrane. The purpose of the 13 original studies combined in the present "Habilitationsschrift" were (i) the characterization of the transport of taurine, leucine and dipeptides at cultured cells of the intestinal, renal and placental epithelium, (ii) the investigation of the structural requirements for transport substrates and (iii) the identification of extra- and intracellular signals for the regulation of epithelial transport processes.
    Methods: Die majority of the studies was performed using cell culture models of epithelia. A variety of biochemical and cell physiological methods was employed.
    Major Results:

  • The colon carcinoma cells HT-29 and Caco-2 express the secondary active Na+/Cl-/taurine symporter. Taurine transport is regulated by protein kinases A and C. Guanylin, the heat-stabile E. coli enterotoxin and cholera toxin represent physiological or pathophysiological regulatory signals for the intestinal taurine transport.
  • The JAR human placental choriocarcinoma cells express the passive amino acid transport system L. The transport function and the pH sensitivity of the system are modulated by calmodulin dependent processes.
  • The intestinal cells Caco-2 and the renal cells MDCK express the tertiary active "low-affinity, high-capacity" H+/peptide symporter PEPT1. The renal cell line SKPT-0193 expresses the tertiary active "high-affinity, low-capacity" H+/peptide symporter PEPT2.
  • The intestinal peptide transport is under the regulatory control of protein kinases A and C at the posttranslational level. Cholera toxin and the heat-labile E. coli enterotoxin represent pathophysiological signals for the regulation of the intestinal peptide transport.
  • PEPT1 accepts amino acid amides depending on the steric, electronic and hydrophobic parameters of the amide structure.
  • The transepithelial flux of ß-lactam antibiotics across Caco-2 cell monolayers and their affinity constants at PEPT1 are significantly correlated. Transport via PEPT1 represents the major absorption route for oral ß-lactam antibiotics.
  • PEPT1 shows conformational specificity. The system selectively binds and transports Xaa-Pro dipeptides and derivatives in their trans conformation.
    • Conclusion: The solute transport systems characterized in the present studies operate with very different mechanisms. The transporters are substrate specific, often epithelium specific and distributed asymmetrically in the cell membranes. Such an arrangement allows the regulation of solute exchange in a qualitative, quantitative and directed manner. In addition, the epithelial cells possess complex mechanisms to adjust transport processes in accordance with the external and internal conditions. For this, the cells receive, transduce and amplify extracellular signals.

    Keywords:
    Epithelien, Darm, Niere, Plazenta, Zellkultur, Transport, Taurin, Dipeptide, ß-Laktam-Antibiotika, Konformation

    epithelia, intestine, kidney, placenta, cell culture, transport, taurine, dipeptides, ß-lactam antibiotics, peptide bond conformation

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    Liste der veröffentlichten Originalarbeiten