Thomas Sutter, Dr. med.

Bedeutung der Cycline für die kolorektale Karzinogenese

Habilitationsschrift zur Erlangung des akademischen Grades habilitierter Doktor der Medizin (Dr. med. habil.) vorgelegt an der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Beschlußdatum 13.05.2003

Abstract
Zielsetzung: In der vorliegenden Arbeit sollen Cycline, den Zellzyklus und damit die Proliferation und/oder die Differenzierung steuernde Gene, sowie verwandte Gene in unterschiedlichen Stufen der Kolonkarzinogenese untersucht werden.
Patienten und Methodik: Primäre Kolonadenome, Kolonkarzinome aller Stadien und korrespondierende normale Kolonmukosa sowie Dünndarmkarzinome wurden anläßlich chirurgischer und endoskopischer Eingriffe von Patienten gewonnen, die in eine Gewebeentnahme einwilligten. Ergänzend hierzu wurden etablierte Zellinien kolorektaler Karzinome sowie eine intestinale Epithelzelline und durch retrovirale Transduktion K-ras oder Cyclin D1 überexprimierende Klone dieser Zellinie untersucht. Die Analysen erfolgten mittels molekularbiologischer Methoden, insbesondere anhand von Western- und Northern-Blot-Analysen, sowie unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion. Zur Sicherung der erhaltenen Ergebnisse wurden immunhistochemische Untersuchungen des Ausgangsgewebes durchgeführt.
Ergebnisse: 1) Mutationen im Codon 12 des K-ras-Protoonkogens sind in Adenokarzinomen des Dünndarms in ähnlicher Häufigkeit nachzuweisen wie in Kolontumoren. 2) Eine Aktivierung des K-ras-Protoonkogens bewirkt eine Cyclin D1-Überexpression in intestinalen Epithelzellen 3) Die G1-Phase Cycline D1 und E weisen in Kolonkarzinomen überwiegend sowohl eine Erhöhung ihrer mRNA- als auch ihrer Proteinexpression auf. 4) Die konstitutive Überexpression von Cyclin D1 in intestinalen Epithelzellen hat weder einen Einfluß auf das Wachstumsverhalten dieser Zellen in vitro noch führt es zur Tumorgenität der Cyclin D1 überexprimierenden Klone in vivo. 5) Eine Überexpression von Cyclin E Proteinen liegt in Kolonkarzinomen, nicht jedoch in deren Vorstufen vor und ist damit eng mit der Transformation kolorektaler Epithelzellen assoziiert. 6) Die Cyclin E Protein- und mRNA-Expressionen kolorektaler Karzinome sind nicht miteinander korreliert. 7) In kolorektalen Karzinomen besteht ein Zusammenhang zwischen einer, im Vergleich zu normaler Kolonmukosa, erhöhten bzw. aberranten Cyclin E Proteinexpression und dem Mutator-Phänotyp dieser Karzinome.
Schlußfolgerung: In kolorektalen Tumoren ist die Cyclin D1 Überexpression teilweise Ausdruck des bereits in der Frühphase der Karzinogenese aktivierten K-ras-Protoonkogens. Cyclin D1 wirkt selbst nicht als Onkogen. Im Gegensatz hierzu scheint eine Überexpression von Cyclin E die maligne Transformation kolorektaler Tumoren zu unterstützen. Ferner könnte eine Erhöhung der Cyclin E Proteinexpression die DNA-Replikation stören und damit bereits defekte DNA-Reparatur-Mechanismen verstärken.

Aim: To examine cyclins, genes governing the cell cycle thus triggering proliferation and/or differentiation, and related genes in different steps of intestinal carcinogenesis.
Patients and methods: Primary colorectal adenoma, colorectal carcinoma of various stages, adjacent normal colonic mucosa and small bowel adenocarcinoma were obtained from surgery and endoscopy. Patients had given informed consens into tissue preservation. In addition, we examined established cell lines from colorectal carcinoma and a cell line derived from intestinal epithelial cells. We further examined K-ras and cyclin D1 overexpressing derivatives of the latter cell line obtained from retroviral gene transduction. Methods of molecular biology were utilized, namely western-, northern blot analysis and polymerase-chain-reactions. To confirm the obtained results immunohistochemical studies were performed using the original tissue specimens.
Results: 1) Small bowel adenocarcinomas displayed codon 12 K-ras mutations at a similiar rate as it was observed in colorectal tumors. 2) Activation of the K-ras protooncogene was followed by cyclin D1 overexpression in intestinal epithelial cells. 3) In colorectal carcinoma, the G1-phase cyclin D1 and E displayed an increased mRNA- and protein expression. 4) In intestinal epithelial cells, constitutive overexpression of cyclin D1 did neither alter growth properties in vitro nor resulted in tumorigenicity of cyclin D1 overexpressing derivatives of these cells. 5) Relative overexpression of cyclin E proteins was observed in an important fraction of colorectal carcinoma when compared to adjacent normal colonic mucosa. In contrast, cyclin E overexpression could not be detected in any colorectal adenoma examined, and this was closely related to the transformation step of colorectal epithelial cells. 6) No relationship between cyclin E protein- and mRNA- expressions could be detected. 7) In colorectal carcinoma, we could demonstrate a relationship between a relatively increased and/or aberrant cyclin E protein expression compared to normal mucosa and a mutator-phenotype of the carcinoma examined.
Conclusion: In colorectal tumors, cyclin D1 overexpression partially results from activated K-ras protooncogenes during the earlier steps of colorectal carcinogenesis. In this context, cyclin D1 does not act as an oncogene itself. In contrast, overexpression of cyclin E may support the transformation of colorectal epithelial cells. The relative abundancy of cyclin E proteins might hinder DNA replication processes and thus enhance the effect of a deficient DNA repair system.

Keywords:
Kolorektales Karzinom, Intestinale Epithelzellen, Zellzyklus, Cyclin D1, Cyclin E, Constitutive Überexpression, Mikrosatelliten-Instabilität

Colorectal carcinoma, Intestinal Epithelial Cells, Cell Cycle, Cyclin D1, Cyclin E, Constitutive Overexpression, Microsatellite Instability

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Referat, Inhalt
1 Einleitung (1-15)
2 Fragestellungen (16-17)
3 Patienten und Methodik (18-20)
4 Ergebnisse (21-29)
5 Diskussion (30-33)
6 Literatur (34-48)
7 Originalarbeiten (49-95)
Anhang - Thesen (II-III)