Hauke Lilie, Dr. rer. nat.

Design und Assoziation multifunktioneller und therapeutisch wirksamer Proteinkomplexe

Kumulative Habilitationsschrift zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium habilitatus (Dr. rer. nat. habil.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Beschlußdatum 17.12.2003

Abstract
Antikörperfragmente tumorspezifischer Antikörper wurden an ein Toxin bzw ein Carriersystem gekoppelt, um diese an Tumorzellen zu adressieren. Als Carriersystem fungierten virusanaloge Partikel des Virushüllproteins Polyoma-VP1. Dabei wurde VP1 auf zwei verschiedene Weisen modifziert, die beide die Kopplung von Antikörpern gewährleisteten. Zum einen wurde VP1 mit der Antikörper-bindenden Domäne Protein Z fusioniert, welche eine Bindung von Antikörpern auf der Oberfläche der Partikel erlaubte; zum anderen wurde ein negativ geladenes, Cystein-haltiges Peptid (E8C) in einen Oberflächenloop von VP1 inseriert. Dies gestattete die kovalente Kopplung von Antikörperfragmenten, die um ein positiv geladenes und ebenfalls Cystein-haltiges Peptid (R8C) verlängert waren. Für beide Arten von virusanalogen Partikeln konnte nachgewiesen werden, dass sie nach Kopplung von tumorspezifischen Antikörpern zelltyp-spezifisch an Zellen binden und in diese aufgenommen werden. Beladung der Partikel mit heterologer DNA führte so zu einer Transduktion der Zielzellen und einem funktionellen Gentransfer.
Das Kopplungsprinzip auf Basis der polyionischen und Cystein-haltigen Fusionspeptide wurde auch verwendet, um ein tumorspezifisches Antikörperfragment an das trunkierte Pseudomonas Exotoxin PE38 zu koppeln. Das entstandene Immunotoxin wies eine zelltyp-spezifische und hohe Cytotoxizität auf und stellt somit eine sehr erfolgreiche Neuentwicklung in dem Gebiet der Immunotoxine dar.

Fragments of tumor specific antibodies were coupled either to a toxin or a carrier system in order to specifically direct them to tumor cells. As carrier system virus-like particles of polyoma-VP1 have been used. VP1 was mutagenized in two different ways that allow a biochemically specific coupling of antibodies. In one case the antibody-binding domain protein Z was fused to VP1, which permitted the binding of antibodies to the surface of the modified virus-like particles. In the other case a negatively charged and cysteine-containing peptide (E8C) was inserted in a surface-exposed loop of VP1. This allowed a covalent coupling of antibody fragments extended by an arginine-rich and cysteine-containing peptide (R8C). After conjugation with tumor-specific antibody fragments both constucts could be addressed specifically to tumor cells; heterologous DNA incorporated in these particles were delivered into and expressed in the target cells.
The coupling procedure based on polyionic and cysteine-containing fusion peptides has also been applied in the conjugation of a tumor-specific antibody fragment with a truncated version of the Pseudomonas exotoxin PE38. The resulting immunotoxin was shown to be highly cytotoxic and depending on the antibody used celltype specific. This design represents a promising new class of biological active immunotoxins.

Keywords:
Gentherapie, Immunotoxin, Vektorsystem, Polyoma, zellspezifisch, polyionische Peptide, Antikörper, Protein Z, VP1

Gene therapy, immunotoxin, vector system, polyoma virus, zell type-specific targeting, polyionic peptides, antibody, protein Z, VP1

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