Yixin Zhang

Rational Design of Cyclosporin A Derivatives for Selective Enzyme Inhibition

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 25.10.2001

Abstract
Cyclosporin A (CsA) ist wirksames Immunsuppressivum. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Herstellung von CsA-Derivaten zur selektiven Enzymhemmung, um zwischen der Inhibierung von Cyclophilin (Cyp) durch CsA bzw. von Calcineurin (CaN) durch den Cyp/CsA-Komplex zu unterschieden. Darüber hinaus wurde die Struktur-Wirkungsbeziehung zwischen CsA-Rückgrat und biologischen Effekten der CsA-Analoga untersucht.
I. Zwei -substitierte [Sarcosin]│-Derivate von CsA inhibieren die Aktivität der Phosphatase CaN in Abwesenheit von Cyp18 mit einem IC50-Wert von 10 ÁM. Damit konnte erstmalig die direkte Inhibierung von CaN durch CsA-Derivate gezeigt werden.
II. Der Einfluß verschiedener Seitenketten der Aminosäure in Position 8 von CsA auf die inhibitorische Aktivität wurde untersucht. Es konnten zwei Verbindungen erhalten werden, die eine wirksame Inhibierung von Cyp18, aber in Form der entsprechenden Cyp18-Ligand-Komplexe nur eine schwache inhibitorische Aktivität gegenüber CaN zeigten.
III. Für die Thioxylierung von CsA wurden unterschiedliche Synthesebedingungen optimiert. Es erfolgte die Synthese einiger entsprechender CsA-Derivate. Der Einfluß der Thioxylierung auf die Konformation und die inhibitorischen Aktivität von CsA wurde untersucht. Durch Laser-Bestrahlung thioxylierter CsA-Derivate konnten reversible Veränderungen in Struktur und Aktivität beobachtet werden.
IV. CsA wurde auf chemischem Weg in Position MeBmt1 phosphoryliert (Cs18). Außerdem erfolgte die Synthese andere CsA-Derivate mit veränderlicher Position 1. Cs18 ist in stimulierten T-Zellen stabil und zeigt eine geringe Zellmembranpermeabilität. Die Modifizierung verursacht eine dramatische Verringerung sowohl der Inhibition von Cyp18 als auch der inhibitorischen Aktivität gegenüber CaN in Gegenwart von Cyp18. Interessanterweise konnte eine wirksame Inhibierung von Pin1 durch Cs18 nachgewiesen werden.
V. Entsprechend der minimalen strukturellen Anforderungen optimaler Katalyse durch Pin1 wurden verschiedene wirksame Pin1-Inhibitoren entwickelt. Ac-Ala-Ala-D-phospho-Ser-Pro-Leu-NH-Np erwies sich als stabil gegenüber zellulären Phosphatasen und Proteasen. Die Verbindung ist ein selektiver, reversibler Inhibitor für Pin1 mit einem IC50-Wert von 1 ÁM.

Cyclosporin A (CsA) is a potent immunosuppressive drug. To distinguish the cyclophilin (Cyp) inhibition by CsA and calcineurin (CaN) inhibition by Cyp/CsA complex, a main aim of this work is to design CsA derivatives for selective enzyme inhibition. The structure-activity relationship of CsA backbone and the biological effects of CsA analogues were also investigated.
I. Two [-substituted sarcosine]3 CsA derivatives can inhibit CaN phosphatase activities in the absence of Cyp18 with IC50 value of 10ÁM. This is the first report that CsA derivatives can inhibit CaN directly.
II. We investigated the effect of various side chains at residue 8 of CsA on the inhibitory activities. Two compounds were obtained with potent Cyp18 inhibitory activities and weak CaN inhibition by Cyp18/ligand complexes.
III. We investigated various conditions for CsA thioxylation and synthesized several thioxylated CsA derivatives. Influences of thioxylation on conformation and inhibitory activities were studied. Laser illumination of these thioxylated CsA derivatives resulted in reversible changes in their structures and activities.
IV. CsA was phosphorylated chemically at MeBmt1 (Cs18). Some other CsA residue 1 derivatives were also synthesized. Cs18 is stable in stimulated T cells and exhibits low cell membrane permeability. The modification results in a dramatic decrease of both Cyp18 inhibition and CaN inhibitory activity in the presence of Cyp18. Interestingly, Cs18 displays potent Pin1 inhibition.
V. According to the structural requirements for Pin1 catalysis, we designed several potent Pin1 inhibitors. Ac-Ala-Ala-D-phospho-Ser-Pro-Leu-NH-Np is stable against cellular phosphatases and proteases. It is a reversible and selective inhibitor to Pin1 with an IC50 of 1 ÁM.

Keywords:
Cyclosporin A, Cyclophilin, Calcineurin, Pin1, PPIases, Inhibitor, Immunsuppressive Wirkstoffe, Synthese, Thioamid, Phosphorylierung

Cyclosporin A, Cyclophilin, Calcineurin, Pin1, PPIases, Inhibitor, Immunosuppressive drug, Synthesis, Thioamide, Phosphorylation

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Inhaltsverzeichnis
Content, Abbreviation
1. Introduction (1-16)
2. Direct CaN inhibition by CsA derivatives (17-31)
3. Design of novel nonimmunosuppressive and Cyp18 inhibiting CsA derivatives (32-41)
4. Reversible Switch of Cyclosporin Conformation (42-57)
5. CsA Phosphorylation (58-72)
6. Design of linear peptidic Pin1 Inhibitors (73-86)
7. Experiments (87-98)
Summary (99-100)
References (101-109)