Stefan Werner

Untersuchungen zur Regulation und Bedeutung der Chitin-Synthese beim Maispathogen Colletotrichum graminicola (CES.) WILS. (Teleomorph: Glomerella graminicola POLITIS)

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 06.06.2002

Abstract
Das fakultative Maispathogen Colletotrichum graminicola (Ces.) Wils. differenziert spezialisierte Infektionsstrukturen, sog. Appressorien, mit deren Hilfe die Wirtsepidermis direkt penetriert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der Zellwandkomponente Chitin für die Stabilität dieser Infektionsstrukturen und von vegetativen Hyphen untersucht. Die Applikation des Chitin Synthase Inhibitors Nikkomycin Z führte zu strukturell anormalen Infektionsstrukturen, die nicht mehr in der Lage waren zu penetrieren.
Mit Hilfe PCR-basierter Methoden konnten drei komplette Chitin Synthase Gene (ChsA-C) und das Fragment eines vierten Gens (ChsD) isoliert werden. Diese lassen sich in die Klassen I (ChsA), III (ChsB) und V (ChsC,D) pilzlicher Chitin Synthasen einordnen, wobei ChsC zur Gruppe der Csm-Gene (Chitin Synthasen mit Myosin-artiger Domäne) gehört. Expressionsanalysen mittels RT-PCR und Promotor-GFP-Fusionen ergaben keinen Hinweis auf eine transkriptionelle Regulation. Die Inaktivierung der drei vollständig isolierten Gene führte zu folgenden Ergebnissen: Mutanten in ChsA und ChsB unterscheiden sich weder in Morphologie noch Pathogenität vom Wildtyp. Im Gegensatz dazu sind ChsC-defiziente Isolate nicht mehr in der Lage, auf normalen Nährmedien zu wachsen. Erst der Zusatz osmotisch aktiver Substanzen ermöglicht das Wachstum. Die Hyphen dieser Mutanten sind trotz osmotischer Stabilisierung blasig angeschwollen, es werden keine Sporenlager mehr gebildet. Eine Besiedlung von Blattgewebe ist auch nach vorhergehender Verwundung nicht mehr möglich.

The fungal maize pathogen Colletotrichum graminicola (Ces.)Wils. differentiates a specialized infection structure, the so-called appressorium, that is used to penetrate the host epidermal cell wall. In this study the role of chitin for the stability of the appressorium and of vegetative hyphae was examined. Infection structures treated with the chitin synthase inhibitor Nikkomycin Z were heavily distorted and were not able to penetrate any more.
Three complete chitin synthase genes (ChsA-C) and the fragment of a fourth gene (ChsD) were isolated using a PCR-based strategy. These genes belong to classes I (ChsA), III (ChsB) and V (ChsC,D) of fungal chitin synthases with ChsC being a member of the Csm group of genes (chitin synthases with myosin-like domain). Transcription of these genes was analyzed using RT-PCR and promoter-GFP fusions but there is no evidence for regulation of expression on this level. The three complete genes were further analyzed by inactivation with the following results: Mutants in ChsA and ChsB could not be distinguished from the wildtyp in terms of morphology and pathogenicity. In contrast, ChsC-deficient isolates were only able to grow on media supplemented with osmotically stabilizing components. Despite this stabilization these mutants exhibited a phenotype with swollen hyphae and lack of sporulation. Growth within leave tissue was completely abolished even after wounding of the leave surface.

Keywords:
Chitin Synthase, Zellwand, Appressorium, Nikkomycin Z, Geninaktivierung, filamentöse Pilze, Pflanzenpathogen, Zea mays

chitin synthase, cell wall, appressorium, Nikkomycin Z, gene knock-out, filamentous fungi, plant pathogen, Zea mays

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung (1-17)
II Material und Methoden (18-41)
III Ergebnisse (42-67)
IV Diskussion (68-85)
V Zusammenfassung (86-88)
VI Literaturverzeichnis (89-102)
VII Anhang (103-115)