Aline Wille

Untersuchungen des Einflusses der antisense-Inhibierung von Kathepsin L auf die funktionelle Aktivitšt von Lungenepithelzellen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 02.05.2002

Abstract
Kathepsin L (catL) zählt zu den Cysteinproteinasen der Papainfamilie. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Untersuchung von Kathepsin L in der humanen Lungenkarzinom Zelllinie A549. Hierfür wurden catL-antisense transfizierte A549-Klone etabliert. Diese zeigten verringerte catL-Konzentrationen auf mRNA-, Protein- und Aktivitätsebene.
Funktionale Analysen zeigten eine verringerte Proliferation und eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber proapoptotischen Reagenzien. Weiterhin konnten wir in den catL-defizienten A549-Klonen eine erhöhte Migrationsrate und eine verstärkte Invasionsfähigkeit gegenüber Matrigelmembranen beobachten. Unter Verwendung von Casein, einem unspezifischen Substrat, zeigte sich eine erhöhte proteolytische Aktivität. Weitere Analysen erbrachten eine erhöhte Kathepsin D-Aktivität und Proteinexpression. Kathepsin D könnte in der Regulation der Apoptose und der Matrixdegradation eine Rolle spielen.
Die catL-defizienten A549-Klone zeigten außerdem eine 5-10-fach erhöhte IL-8-Sekretion im Vergleich zu Kontrollzellen, dass eine Erklärung für die erhöhte Migration sein könnte. Die Produktion von IL-6, IL-18 und TGF-ß1/2 dagegen blieb unbeeinflusst. Die MCP-1-Sekretion war dagegen reduziert.
Zusammenfassend zeigen die Daten, dass Kathepsin L wahrscheinlich an der Regulation der Zytokinproduktion und der Kathepsin D-Expression beteiligt ist. Darüber hinaus wird die Apoptoseinduktion durch eine Kathepsin L- Inhibierung beeinflusst.

Cathepsin L (catL) is a cysteine protease of the papain family. The aim of the present study was to investigate the functional role of cathepsin L in the human lung carcinoma cell line A549. Therefore, catL antisense transfected A549 clones were generated. They showed decreased catL-specific mRNA levels, protein concentrations and proteolytical activities.
Functional analyses revealed a decreased growth rate associated with an increased sensitivity to proapoptotic agents. Additionally, we observed in catL-deficient A549 cells an increased migration rate as well as an enhanced invasion into matrigel. Using casein as an unspecific substrate we found an increased proteolytic activity. Further analyses revealed an increased cathepsin D activity and protein expression. Recently, it was shown that cathepsin D may be involved in the regulation of apoptosis as well as in matrix destruction.
Furthermore, the catL-deficient A549 cells showed an 5-10-fold enhanced IL-8 secretion in comparison to control cells, which may be another explanation for the increased migration. The production of IL-6, IL-18 and TGF-ß1/2 was not affected, whereas the MCP-1 production was rather decreased.
In conclusion, the data suggest that cathepsin L may be involved in the regulation of cytokine production and cathepsin D expression thereby affecting the induction of apoptosis of the A549 cells.

Keywords:
A549, Humane Lungenkarzinom Zelllinie, Kathepsin L, Proliferation, Proapoptotische Reagenzien, Migration, Invasion, Proteolytische Aktivität, Kathepsin D, Interleukin-8

A549, Human lung carcinoma cell line, Cathepsin L, Growth rate, Sensitivity to proapoptotic agents, Migration, Invasion, Proteolytic activity, Cathepsin D, Interleukin-8

Online-Dokument im PDF-Format (565 KB) mit integrierter Gliederung.

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis, Verwendete Puffer und Reagenzien
1 Einleitung (4-13)
2 Methoden (14-49)
3 Ergebnisse (50-77)
4 Diskussion (78-94)
5 Zusammenfassung (95-98)
6 Literatur (99-111)