Wim Reidt

Analysis of transcription factors during late-embryogenesis: the role of FUS3, LEC1, ABI3 and AtET

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 16.05.2002

Abstract
Die späte Embryogenese und Samenreifung ist durch drei Prozesse gekennzeichnet: Akkumulation von Speicherstoffen, Erwerb der Austrocknungstoleranz aller Gewebe und Ausprägung der Samenruhe. Genetische Untersuchungen belegen, dass die Transkriptionsfaktoren (TF) FUS3, ABI3 und LEC1 an der Kontrolle der Prozesse der späten Embryogenese beteiligt sind. Die regulatorischen Interaktionen der drei TF untereinander bzw. mit ihren target-Genen waren weitgehend unklar. Ziel der vorliegenden Arbeit war einen Beitrag zu deren Aufklärung leisten.
Für die Untersuchung der Interaktion zwischen der drei TF untereinader und auf die Aktivität von Samenprotein-promoteren wurde ein transientes Expressionsystem auf der Basis von isolierten Tabak-Protoplasten etabliert. Die Ergebnisse zeigen, dass in diesem Expressionssystem die TF FUS3 und ABI3 abhänging und unabhängig voneinander die Aktivität von Samenprotein promoteren induzieren. Die FUS3- und ABI3-abhängige Promotoraktivierung konnte durch die Zerstörung ein konservierten cis-Elements, das RY-Element, weitgehend reduziert werden. Das führte zu der Hypothese, dass RY-Promotorelemente das direkte Bindungsmotif des FUS3 TF sind. Die physische Interaktion zwischen dem FUS3-TF und dem intakten RY-Promotorelement wurde durch band shift-Experimente gezeigt. Experimente mit Promotorelementen samenspezifischer Gene und Kotyledonen-spezifischen cDNA-Expressionsbanken aus Vicia faba und Brassica napus führten zur Isolierung zwei neue Gene, VfET und BnET. Im Arabidopsis-Genom werden drei ähnliche Gene gefunden. Die ektopische Expression von BnET-cDNA führt zu ausgeprägtem Zwergwachstum. Wenngleich die Funktion des ET-TF noch weitgehend unklar ist, wird eine Funktion bei der Repression der Zellteilung postuliert.

Late-embryogenesis is characterised by the accumulation of large amounts of storage proteins, the acquisation of desiccation tolerance and the induction of dormancy. Genetic studies demonstrated that these processes are controlled by the transcription factors LEC1, FUS3 and ABI3. The present study was focused on the molecular characterisation of FUS3, LEC1 and ABI3 in an attempt to clarify the interaction of these transcription factors and their role in late-embryogenesis.
To investigate the potential interaction between FUS3, ABI3 and LEC1 and their function on the activation of seed-storage protein promoters a transient expression system in tobacco protoplasts was established. With the help of this system it was shown that the FUS3- and ABI3-gene products can induce both independently and dependently of each other storage protein promoters. The FUS3 and ABI3 mediated increase in activity of storage protein promoters could be strongly reduced when a conserved sequence element, the RY motif, was mutated. The suggestion that this motif could therefore be a direct target of the FUS3 protein was confirmed by band-shift assays. Screening for additional factors regulating seed storage protein expression resulted into the isolation of two proteins one from B. napus, BnET and one from V. faba, VfET. Three genes displaying sequence similarity to the cDNA sequence of BnET and VfET are also present in the Arabidopsis genome. Ectopical overexpression of BnET in N. tabacum resulted into plants with a strong dwarf phenotype. Although the function of this protein is still speculative it may play a role in the repression of cell division.

Keywords:
Embryogenese, Transkriptions Faktoren, Transiente Versuche, Gibberellin Säure, Samenreifung, Samen-specifische Promoteren, RY-Promoterelement

Embryogenesis, transcription factors, transient assays, gibberellic acid, seed maturation, seed-specific promoters, RY-element

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Inhaltsverzeichnis
Contents, abbreviations
1. Introduction (1-13)
2. Material and methods (14-24)
3. Results (25-52)
4. Discussion (53-65)
5. Conclusions and outlook (66-68)
6. Abstract (69-71)
7. Zusammenfassung (72-74)
8. References (75-86)
Publication of results, Poster
Appendix