Una Rauchhaus

Untersuchungen zur Bedeutung der Chitindeacetylase 1 pathogener Hyphen von Colletotrichum graminicola (Ces.) Wils. während der frühen Infektionsphasen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 29.10.2002

Abstract
In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der Chitindeacetylase1 des Maispathogen Colletotrichum graminicola (Cesati) Wilson für eine erfolgreiche Infektion untersucht.
Mit Hilfe einer heterologen Sonde gelang es, das Gen für die Chitindeacetylase1 aus C. graminicola (CgCda1) zu isolieren. Dieses wurde anschließend vollständig sequenziert. Es kodiert für ein sekretiertes Protein, welches nach Abspaltung des Signalpeptides eine Größe von 25,1 kDa besitzt. Die Ergebnisse aus RT-PCR Untersuchungen und Western Blot deuten darauf hin, dass die Chitindeacetylase1 in C. graminicola in vegetativen Hyphen und in Infektionsstrukturen exprimiert wird. Transkripte finden sich ebenfalls in frühen, nicht aber in älteren Stadien der Infektion.
Es wurden Chitindeacetylase1-defiziente Mutanten durch gene disruption hergestellt und im Infektions-test überprüft. Es konnte keine Funktion von CgCda1 in Bezug auf Wachstum, Differenzierung von Infektionsstrukturen und Pathogenität festgestellt werden. Rückschlüsse auf die Bedeutung einer Chitindeacetylase für eine erfolgreiche Infektion werden erschwert, da eine dritte Chitindeacetylase-Isoform auch bei den Cgcda1 Mutanten nachweisbar bleibt.
Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer Methoden wurde die Modifikation der Oberflächenkohlenhydrate der Zellwand während der Differenzierung von Infektionsstrukturen analysiert. Dabei wurden sowohl in vivo- als auch in vitro-differenzierte Strukturen in die Analyse einbezogen. Eine Modifikation der Zellwand während der Penetration in das Wirtsgewebe kann gezeigt werden. Die Oberfläche von Infektionsvesikel und primären intrazellulären Hyphen wird von Chitosan dominiert. Chitin kann innerhalb des Blattes nur am Apex penetrierender Hyphen nachgewiesen werden. Die Inaktivierung der Chitindeacetylase1 in C. graminicola hat keine Auswirkungen auf die Verteilung von Chitin und Chitosan in der Zellwand der Infektionsstrukturen.

In this study the role of chitin deacetylase in modification of surface carbohydrates of fungal infection structures of the maize pathogen Colletotrichum graminicola (Cesati) Wilson was examined.
A heterologous probe was used to isolate the gene for chitin deacetylase1 (CgCda1) of C. graminicola. This gene was sequenced subsequently. It encodes a secreted protein with a deduced molecular weight of 25,1 kDa after cleavage of the signal peptide. Results from RT-PCR studies and Western Blot indicate that chitin deacetylase1 of C. graminicola is expressed in vegetative hyphae and infection structures. Transcrips were found in early but not in older states of infection.
Mutants with an inactivated CgCda1 gene were generated by gene disruption and tested in infection studies. No evidence for a role of CgCda1 in growth, differentiation of infection structures and pathogenity was found. It was difficult to assess the importance of chitin deacetylation for successful infection because a third chitin deacetylase isozyme is still active in the Cgcda1 mutants.
The modification of carbohydrates of the cell wall during the differentiation of infection structures was analysed by different microscopical techniques. In vivo- and in vitro-differentiated infection structures were analysed. Importantly, Chitosan but not chitin is the surface carbohydrate in infection vesicles. Consequently a modification of cell wall during penetration of host tissue can be shown.
Inactivation of chitin deacetylase1 in C. graminicola had no effect on the specific distribution of chitin and chitosan in the cell wall of infection structures.

Keywords:
Chitindeacetylase, Chitosanchitosan, Chitin, Colletotrichum graminicola, Oberflächenmodifikation, Pilzliche Zellwandbiogenese, Hemibiotrophes Pathogen, Oberflächenkohlenhydrate

chitin deacetylase, chitosan, chitin, Colletotrichum graminicola, surface modification, fungal cell wall biogeneses, hemibiotrophic pathogen, surface carbohydrate

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung (1-14)
II. Material und Methoden (15-41)
III. Ergebnisse (42-70)
IV. Diskussion (71-94)
V. Zusammenfassung (95-98)
VI. Literaturverzeichnis (99-115)
VII. Anhang (116-123)