Katrin Viehweger

Der Protonentransport an der Vakuole - ein Signalschritt zur Auslösung der Biosynthese von Benzophenanthridin-Alkaloiden in Eschscholzia californica

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 28.03.2003

Abstract
Zellsuspensionen von Eschscholzia californica reagieren auf einen Hefe-Elicitor (Glycoproteinfraktion) mit der Bildung von Benzophenanthridin-Alkaloiden. Ein intermediärer Signalschritt ist der Efflux von Protonen aus der Vakuole, welcher zu einer transienten Ansäuerung im Cytoplasma führt.
Auf der Suche nach dem zugrunde liegenden Mechanismus wurde ein in-situ-System zur Untersuchung vakuolärer Protonenfluxe entwickelt, welches auf der Permeabilisierung der Plasmamembran für Mikromoleküle < 40 kDa beruht. Die in-situ-Vakuolen erwiesen sich als funktionell intakt, wie durch die Aktivität der Protonenpumpen (V-ATPase, V-PPase, charakterisiert über die Wirkung von Energiequellen und Hemmstoffen) und dem Nachweis von Na+/H+ und Ca2+/H+-Austauschvorgängen belegt wurde. Mit Hilfe der konfokalen pH Topografie der in-situ-Vakuolen wurden Lysophosphatidylcholin (LPC) und Diacylglycerol (DAG) als Auslöser eines Efflux vakuolärer Protonen identifiziert. Die Wirkung von LPC beruht höchstwahrscheinlich auf der Stimulation eines Na+/H+-Austauschers am Tonoplasten.
An Ganzzellen wurde mit Hilfe statistischer Verfahren (Kontingenztafeln, exakter Test nach Fischer) eine Korrelation der Signalereignisse "PLA2-Aktivität" und "pH-shift" mit der Zellantwort "Alkaloidbiosynthese" für ca. 1/3 aller Zellen gezeigt. Diese Korrelation ist weder bei sehr hohen Elicitorkonzentrationen noch in einer transgenen antisense G-Zellinie nachweisbar. Die Ergebnisse sprechen für die Existenz eines durch niedrige Elicitorkonzentrationen ausgelösten Signalweges, welcher nacheinander die Aktivierung einer PLA2 in der Plasmamembran und eines Na+/H+-Austauschers in der Vakuolenmembran beinhaltet.

Cultured cells of Eschscholzia californica respond to a yeast elicitor (glycoprotein fraction) with overproduction of benzophenanthridine alkaloids. The signal path includes the efflux of protons from the vacuole thus giving rise to a transient acidification of the cytoplasm.
Stimulators of the efflux of vacuolar protons were identified in situ, i.e. after the selective permeabilization of the plasma membrane for micromolecules < 40 kDa. The in-situ-vacuoles proved to be functionally intact as demonstrated by the activity of the proton pumps (V-ATPase, V-PPase, characterised via energy sources and inhibitors) and of Na+/H+ and Ca2+/H+ antiporters. By confocal pH-topography of the vacuolar interior it was found that lysophosphatidylcholine (LPC) and diacylglycerol (DAG) triggered an efflux of protons from the vacuolar pool . LPC most probably acts by increasing the Na+-sensitivity of the Na+/H+- antiporter. With intact cells, statistical analysis (contingency tables, Fischers's test) revealed a correlation of the signal steps "PLA2-activity" und "pH-shift" to the cellular response "alkaloid biosynthesis" in around 1/3 of the cells. This correlation was absent if either high elicitor concentrations or a transgenic antisense-G cell line was used. The data support the existence of a signal path triggered by low elicitor concentrations that includes subsequent activation of PLA2 at the plasmamembrane and of Na+/H+-antiporters at the vacuolar membrane.

Keywords:
Vakuole, in-situ, Protonentransport, pH-Signal, Lysophosphatidylcholin, Na+/H+-Austauscher, Benzophenanthridin-Alkaloide

vacuole, in-situ, proton transport, pH-signaling, lysophosphatidylcholine, Na+/H+ exchanger, benzophenanthridine alkaloids

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis (1,1-5)
Wissenschaftlicher Hintergrund
1 Das pH-Signal (6-19)
Methoden
2 Methodenentwicklungen (20-42)
3 Experimenteller Teil (43-52)
Ergebnisse
4 Ionenfluxe an in-situ-Vakuolen von Eschscholzia californica (53-82)
5 Eine Sequenz von Signalereignissen nach Elicitorkontakt in Ganzzellen von Eschscholzia californica (82-99)
Schlussfolgerungen
6 Schlussfolgerungen (100-108)
7 Zusammenfassung (Inhalt der Thesen) (109-111)
8 Literaturverzeichnis (112-128)
9 Abkürzungsverzeichnis (129-131)
10 Abbildungsverzeichnis und Tabellen (132-134)