Gabriele Schumacher

Dynamisches Testsystem zur Untersuchung der Bindungseigenschaften im Selektin-vermittelten Zellrollprozess und zum Screening potentieller Wirkstoffe

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 04.07.2003

Abstract
Die Selektine, eine Gruppe von drei Kohlenhydrat(Sialyl-Lewisx)-bindenden Glykoproteinen, lösen im Zuge der unspezifischen Immunabwehr eine Kaskade von Adhäsionsereignissen aus, indem sie die Leukozyten aus dem Blutstrom "abfangen" und in eine rollende Verlangsamung entlang des Endothels überführen. Nach ihrem Vorkommen werden sie als L-(Leukozyten-), E-(Endothel-) und P-(Plättchen und Endothel)Selektin bezeichnet. Eine pathologische Beteiligung der Selektine und der von ihnen unterstützten Rollbewegung wird bei entzündlichen Erkrankungen, angiogenetischen und metastatischen Krankheitsverläufen diskutiert. Da die Selektine am Anfang der Adhäsionskaskade stehen und ihre Expression räumlich und zeitlich auf das entzündete Gewebe beschränkt ist, sind sie als pharmakologische Zielstruktur prädestiniert.
Um therapeutisch in durch Selektine vermittelte Abläufe eingreifen zu können, sind Kenntnisse über die molekulare Basis der Selektin-Interaktionen unerlässlich. In der vorliegenden Arbeit wird die Ligandenpräsentation in Bezug auf Flexibilität und die Bedeutung der Multivalenz untersucht. Um dabei die Auswirkungen der Scherkraft auf die Selektin-Bindung zu berücksichtigen, wird ein dynamisches Testsystem verwendet. Es kann die Wechselwirkung Selektin-tragender Zellen mit Glykolipidliganden in einer Lipidmembran oder die Wechselwirkung Ligand-tragender Zellen mit immobilisiertem Selektin gemessen werden. Etabliert wird eine computergestützte Auswertung der Rollgeschwindigkeit sowie der Zelladhäsion. Das Anwendungsgebiet des Testsystems wird auf das Screening löslicher Selektin-Inhibitoren ausgedehnt. Untersucht werden Sialyl-Lewisx-Mimetika, sulfatierte Polysaccharide sowie Oligosaccharide der humanen Milch und Struktur-Wirkungs-Beziehungen abgeleitet. Um die Rolle von Selektinen bei Tumorerkrankungen zu analysieren, wurde die Wechselwirkung verschiedener Gewebetumorzelllinien mit P- und L-Selektin untersucht. Die Betonung liegt dabei auf der Frage, ob das Rollen von Tumorzellen der Initialschritt bei der Metastasierung sein kann. Im Anschluss daran werden verschiedene Substanzen auf ihre Fähigkeit zur Unterdrückung der Krebszelladhäsion geprüft.
Abschließend lässt sich sagen, dass das Testsystem hervorragend geeignet ist, sensitiv und spezifisch Selektin-Inhibitoren von wirkungslosen Substanzen zu diskriminieren. Es ist daher gut für das Screening möglicher Selektin-Inhibitoren geeignet. Durch die freie Auswahl von Zellen, Selektinen und deren artifiziellen Liganden ist die Anordnung sehr variabel.

The selectins, a group of three carbohydrate(SialylLewisX)-binding glycoproteins, initiate an adhesion cascade in the course of the process of the unspecific immune defence by capturing the leukocytes from the blood stream and transfering them into a rolling movement along the endothelium. According to their expression they are refered to as L-(leukocyte-), E-(endothelium-) and P-(platelet and endothelium)selectin. A pathological involvement of the selectins and the rolling movement triggered is discussed in inflammatory, angiogenetic and metastatic diseases. As the selectins are positioned at the beginning of the adhesion cascade and their expression is locally and temporary restricted to inflammatory tissue, they are predestinated as pharmacological target molecules.
In order to interfere therapeutically with Selectin-induced processes, detailled knowledge about the molecular basis of Selectin-interactions is necessary. In this thesis the presentation of the ligands is analysed with respect to flexibility and the significance of multivalency. To consider the impact of shear force on Selectin-binding a dynamic testsystem is used. The interaction of Selectin-bearing cells with glycolipid-ligands or the interaction of ligand-carrying cells with immobilised selectins can be measured. A computer based analysis of the rolling velocity and cell adhesion is established. The area of application of the test system is extended to the screening of soluble Selectin-inhibitors. SialylLewisX-mimetics, sulfated polysaccharides and oligosaccharides derived from human milk are tested and structure-activity-relationships are deduced. To analyse the role of Selectins within metastatic diseases the interaction of different tumor cell lines originating from tissue with P- and L-Selectin is investigated. Emphasis is placed on the question wether rolling can be the initial step of the metastatic process. Subsequently the ability of different substances to suppress the Selectin-induced tumorcell adhesion is tested.
It can be concluded that the testsystem is excellently suited to distinguish sensitively and specifically between Selectin-inhibitors and ineffective substances. Therefore it is highly qualified for the screening of potential Selectin-inhibitors. The system is very adjustable because of the free choice of cells, Selectins and their artificial ligands.

Keywords:
Adhäsion, In vitro Assay, Modellmembran, Selektin, Flusskammer, Dynamisches Testsystem, Inhibierung, Entzündung, Metastasierung

Adhesion, In vitro assay, Model membrane, Selectin, Flow chamber, Dynamic test system, Inhibition, Inflammation, Metastasis

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (1, 1-4)
1 Einleitung (5)
2 Theoretischer Teil (6-45)
3 Materialien und Methoden (46-55)
4 Ergebnisse und Diskussion (56-95)
5 Zusammenfassung (96-98)
6 Literaturverzeichnis (99-127)
Eigene Veröffentlichungen (128)