Nico Wippich

Nachweismöglichkeiten reaktiver Sauerstoffspezies am Beispiel der Xanthin- und der NAD(P)H-Oxidase

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt an der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 08.10.2003

Abstract
In dieser Arbeit wurde das Reaktionsverhalten von Xanthinoxidase aus Buttermilch (XObm) und von Mikroorganismen (XOmo) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß beide Enzyme H2O2 generieren, die XOmo im Gegensatz zur XObm aber keine ĽO2- bildet. Der Einsatz der XOmo als in vitro-Schädigungsgenerator für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ist daher abzulehnen.
Weiterhin erfolgte eine Charakterisierung der verwendeten ĽO2--Detektionssysteme. Die Sensitivität der Coelenterazin-Chemilumineszenz (CL) liegt im Vergleich zur Lucigenin-CL um den Faktor 25 höher. Lucigenin selbst führte bis zu einer Initialkonzentration von 250 ÁM zu keiner artifiziellen Radikalgenerierung. Bei Einsatz von Cytochrom c ist zur Vermeidung einer Reoxidation Katalase notwendig. Die spin trap DEPMPO weist im Vergleich zu DMPO eine deutlich höhere Stabilität ihres ĽO2--Adduktes auf. NBT ist auf Grund seiner Unspezifität als ĽO2--Detektor ungeeignet.
Ziel war weiterhin der Nachweis der funktionellen Stimulierbarkeit der NAD(P)H-Oxidase in humanen Endothelzellen von Nabelschnurvenen (HUVEC). Mittels der Coelenterazin-CL konnte eine Zunahme der ROS-Generierung um 38 % nach Inkubation mit Endothelin-1 (ET-1) festgestellt werden. Diese korreliert mit der früher nachgewiesenen Steigerung der mRNA-Expression von gp91phox, einer Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase, durch ET-1. gp91phox könnte somit einen limitierenden Faktor der ROS-Generierung darstellen.

In this study we investigated the reaction behaviour of xanthine oxidase from buttermilk (XObm) and from microorganisms (XOmo). We could show that both enzymes generate H2O2 but XOmo is not able to generate ĽO2-. Therefore XOmo should not be used as a generator for reactive oxygen species.
Furthermore we characterised the different systems to detect ĽO2-. Coelenterazine is much more sensitive (by factor 25) than Lucigenin in chemiluminescence (CL). Up to initial concentrations of 250 ÁM, Lucigenin does not generate ĽO2- through redox cycling. If cytochrome c is used as detector for ĽO2-, the presence of catalase is necessary . The spin adduct of DEPMPO is much more stable than the adduct of DMPO. NBT should not be used due to its low specificity in detecting ĽO2-.
Also we investigated whether there is a functional stimulation of the NAD(P)H oxidase in human umbilical vein endothelial cells. We could detect a 38 % higher generation of ROS after incubation with endothelin-1 (ET-1) using coelenterazine CL. This correlates with the stimulation of expression of gp91phox mRNA after ET-1 incubation. gp91phox is a sub-unit of the NAD(P)H oxidase and possibly could limit the activity of the enzyme.

Keywords:
Xanthin-Oxidase, NAD(P)H-Oxidase, Superoxidanionen, HUVEC, Mikroorganismen, Buttermilch, Endothelin-1, Lucigenin, Coelenterazin, gp91phox

xanthine oxidase, NAD(P)H oxidase, superoxide anion, HUVEC, microorganism, butter milk, endothelin-1, lucigenin, coelenterazine, gp91phox

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Referat, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (I-VII)
1 Einleitung (1-12)
2 Zielstellung (13)
3 Material und Methodik (14-20)
4 Ergebnisse (21-32)
5 Diskussion (33-44)
6 Zusammenfassung (45-46)
7 Literaturverzeichnis (47-53)
8 Thesen (54-56)
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