Stephan Schilling

Charakterisierung der humanen Glutaminyl-Cyclase im Vergleich mit dem analogen Enzym aus Carica papaya

Kumulative Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 05.05.2004

Abstract
Glutaminyl-Cyclasen (QC; EC 2.3.2.5) sind im Tier- und Pflanzenreich vorkommende Enzyme, welche die Umsetzung von N-terminalem Glutamin zu Pyroglutamat katalysieren. Die QCs der Säuger sind an der Reifung von Peptidhormonen beteiligt. Die QCs tierischen und pflanzlichen Ursprungs zeigen keine Homologie in ihrer Primärstruktur.
In der vorliegenden Arbeit wurden die katalytischen Eigenschaften der humanen QC und der pflanzlichen QC aus Carica papaya verglichen. Es wurden neue, kontinuierliche Testmethoden zum Nachweis der QC-Aktivität entwickelt und die heterologe Expression der humanen QC in der Hefe Pichia pastoris etabliert. Die pflanzliche QC wurde aus Papaya Latex gereinigt. Humane QC und Papaya-QC zeigen eine sehr ähnliche katalytische Spezifität gegenüber Oligopeptiden und eine ähnliche pH-Abhängigkeit des Substratumsatzes. Beide Enzyme katalysieren auch die Zyklisierung N-terminaler Glutamylreste unter schwach sauren Bedingungen. Unterschiede bestehen hauptsächlich in der Umsetzung von Dipeptid-Substraten und nicht-physiologischen Dipeptid-Analoga. Die Inhibierung der humanen QC durch Imidazolderivate und heterozyklische Komplexbildner sowie die Reaktivierung von inaktivem Apoenzym durch Zink-Ionen belegen die Metallabhängigkeit des Enzyms. Die pflanzliche QC aus C. papaya wurde durch diese Inhibitoren nicht beeinflusst, es katalysiert metallunabhängig.
Die Ergebnisse weisen auf eine generell ähnliche Wirkungsweise der analogen QC tierischen und pflanzlichen Ursprungs hin. Die Metallabhängigkeit der Katalyse tierischer QCs in Analogie zu Aminopeptidasen deutet auf eine Interaktion des Metallions mit der -Carbonylgruppe des N-terminalen Glutamins im Substrat hin, was zur Beschleunigung der intramolekularen Reaktion führt. Die Umsetzung N-terminaler Glutamylreste durch humane QC könnte auf eine wichtige Rolle bei der Bildung der amyloidogenen pGlu3-A4 Peptide hinweisen, die eine Rolle bei der Entstehung der Alzheimerschen Erkrankung spielen. Die humane QC wird als neues Zielenzym für die Alzheimer-Wirkstoffforschung vorgeschlagen.

Glutaminyl cyclases (QC; EC 2.3.2.5) are enzymes present in animals and plants, catalyzing the conversion of N-terminal glutaminyl residues into pyroglutamic acid. Mammalian QCs are involved in maturation of several hormones. The QC-forms of plants and animals display no homology in terms of primary structure.
The characteristics of the plant QC from Carica papaya and of human QC were compared in the dissertation. New continuous enzymatic assays were developed and human QC was expressed heterologously in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Plant QC was purified from papaya latex. Human and papaya QC show a similar catalytic specificity towards oligopeptides and a similar pH-dependence of catalysis. Both QC-forms catalyze the cyclization of N-terminal glutamyl residues under mildly acidic pH. Differences, however, were observed in conversion of dipeptides and dipeptide analogs. Human QC was inhibited by imidazole derivatives and heterocyclic chelators. QC-apoenzyme was reactivated by transition metal ions, e.g. zinc ions, revealing human QC as a metal-dependent enzyme. Papaya QC was neither inhibited by imidazoles, nor by chelators. Hence, plant QCs catalyze metal independent.
The results point to a similar catalytic mechanism of QCs from plants and animals in general. The metal dependent catalysis of human QC could indicate an interaction of the -carbonyl group of the N-terminal glutaminyl residue of the substrate with the active site-bound metal ion, leading to acceleration of the intramolecular cyclization reaction. The conversion of N-terminal glutamyl residues by human QC could be responsible for generation of amyloidogenic pGlu3-A peptides, which play an important role in the initiation of Alzheimer's disease. Thus, human QC is suggested as a target for drug development.

Keywords:
Alzheimersche Erkrankung, Glutaminyl-Cyclase, Glutamin-Cyclotransferase, Hormonreifung, 5-Oxo-Prolin, pGlu

Alzheimer's disease, glutaminyl cyclase, glutamine cyclotransferase, hormone maturation, 5-oxo-proline, pGlu

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1-3)
1 Einleitung - Ziel der Arbeit (4-5)
2 Vorkommen, Biosynthese und Struktur der Glutaminyl-Cyclasen (QCs) (5-11)
3 Der Reaktionsmechanismus der QCs (12-21)
4 Die physiologische Funktion der QC (21-24)
5 Humane QC - Zielenzym für die Wirkstoffentwicklung (24-31)
6 Zusammenfassung (32-33)
7 Literatur (34-41)
8 Angefügte Publikationen und Manuskripte (90 S.)