Mirja Wüster

Immunhistochemische Untersuchungen apoptose- und proliferationsassoziierter Proteine beim klarzelligen Nierenzellkarzinom in Bezug auf klinisch-pathologische Parameter und prognostische Bedeutung

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt an der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 24.05.2004

Abstract
Das Nierenzellkarzinom (NZK), dessen meistvertretenen Subtyp das klarzellige NZK darstellt, ist der häufigste maligne renale Tumor und weist eine auch nach kurativ intendierter Nephrektomie schwer abschätzbare Langzeitprognose sowie eine geringe Ansprechrate auf adjuvante Therapien auf.
Da in jüngerer Vergangenheit die im Zusammenhang mit proliferativen Prozessen zu sehende essenzielle Bedeutung der Apoptose für den Tumorprozeß bekannt wurde, widmete sich die vorliegende Untersuchung der Expression von apoptose- und proliferationsrelevanten Proteinen beim klarzelligen NZK, ihren Interrelationen sowie ihrer potentiellen prognostischen Bedeutung.
Hierzu wurden Schnittpräparate von 23 formalinfixierten, paraffineingebetteten NZK-Gewebeproben immunhistochemisch auf die Expression von Bcl-2, Ki-67, p53 und VHL sowie mittels des TUNEL-Verfahrens auf den Anteil apoptotischer Zellen untersucht. Die untersuchten Parameter wurden bezüglich ihrer Assoziationen untereinander sowie mit pT-Stadium und nukleärem Grading sowie ihren Einfluss auf das rezidivfreie Überlebensintervall ausgewertet.
Von den untersuchten NZK wiesen 43,5 % eine apoptotische Aktivität auf, wobei ein Apoptosenachweis eng mit einem höheren nukleären Grading assoziiert war. Die beobachteten Anteile Ki-67-positiver Zellen waren insgesamt vergleichsweise gering und zeigten keine Assoziation mit klinisch-pathologischen Parametern; es bestand jedoch eine signifikant positive Korrelation mit der p53- und VHL-Proteinexpression. Alle untersuchten NZK wiesen eine ausgeprägte Bcl-2-Expression auf, wobei das Ausmaß dieser Expression in keinem signifikanten Zusammenhang mit einem der immunhistochemischen oder klinisch-pathologischen Parameter stand. Die p53-Expression der 23 untersuchten NZK erwies als relativ hoch: 60,1 % der NZK wiesen > 1 % p53-positiver Zellen auf; 43,5 % der Fälle boten Anteile von > 5 % p53-positiver Zellen. Es bestand eine enge positive Assoziation zwischen der p53- und der VHL-Expression. Nahezu 40 % der NZK-Proben wiesen einen vollständigen VHL-Expressionsverlust auf. Eine VHL-Expression in < 20 % der Zellen wirkte sich tendenziell nachteilig auf das rezidivfreie Überlebensintervall aus. Das nukleäre Grading und das pT-Stadium wiesen eine signifikant positive Korrelation auf.
Die erzielten Resultate weisen auf eine potentielle Verwertbarkeit der Apoptosehäufigkeit und eventuell auch der VHL-Expression als Prognosefaktoren für das klarzellige NZK hin. Außerdem scheinen angesichts der hier beobachteten Expressionsmuster p53-Alterationen beim klarzelligem NZK häufiger aufzutreten, als vielfach angenommen; in Anbetracht der positiven Korrelation der p53- und VHL-Expression stellen Alterationen der genannten Gene möglicherweise alternative Karzinogenesemechanismen für das NZK dar. Die beobachtete insgesamt hohe Bcl-2-Expression impliziert eine funktionelle Bedeutung dieses Proteins beim klarzelligen NZK und bietet einen möglichen pharmakotherapeutischen Angriffspunkt für die Behandlung des klarzelligen NZK.

Renal cell carcinoma (RCC), of which the clear cell subtype is most frequently seen, represents the most frequent malignant tumor of the kidney and shows, even after radical nephrectomy, a hardly predictable long-term outcome as well as a low responsiveness to irradiation or chemotherapeutic drugs.
Since in the recent past the eminent importance of apoptosis for tumor formation and growth due to its influence on proliferation became evident, the present study examinated the expression of apoptosis- and proliferation-related proteins in clear cell RCC, their interrelations and their possible prognostic impact.
In specimens of 23 formaline-fixed, paraffin-embedded clear cell RCC, the expression patterns of Bcl-2, Ki-67, p53 and VHL where detected by immunostaining, and the number of apoptotic cells was estimated using the TUNEL method. The examined parameters were evaluated regarding their associations with each other and with pT tumor stage and nuclear grading as well as their influence on progression-free survival.
43.5% of the examined RCC showed apoptotic activity, and a higher frequency of apoptosis was closely related with an higher nuclear grading. The counts of Ki-67 positive cells were low and did not show any association with clinicopathological parameters; but there was a significantly positive correlation with p53 and VHL protein expression. All RCC demonstrated a high Bcl 2 positivity, however, the extend of Bcl-2 expression was not significantly correlated with one of the other immunohistochemical or clinicopathological parameters. The p53 expression of the 23 RCC was relatively high: 60.1% of the NZK showed > 1% p53-positive cells; 43.5% demonstrated a positive staining in > 5 % of the cells. The p53 and VHL expression where closely related.
Almost 40% of the RCC showed a complete loss of VHL-expression. There was a tendancy towards a lower progression-free survival among patients whose tumors showed < 20 % VHL-positive cells. Nuclear grading and pT stage were significantly correlated.
These results suggest a possible meaning of apoptotic counts and, perhaps, VHL expression patterns as prognosticators in clear cell RCC. In addition, p53 alterations in clear cell RCC seem to be more common than frequently assumed. Considering the positive correlation between p53 and VHL expression, alterations of these genes could be alternative mechanisms of carcinogenesis in RCC.
The high overall Bcl-2 expression implies a functional meaning of this protein for clear cell RCC and offers a possible pharmacological target for its treatment.

Keywords:
Nierenzellkarzinom; NZK; klarzellig; Apoptose; Proliferation; Immunhistochemie; Prognose; Therapie

renal cell carcinoma; RCC; clear cell; apoptosis; proliferation; immunohistochemistry; prognosis; therapy

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Referat, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung und Zielstellung (1-12)
2 Material und Methoden (13-19)
3 Ergebnisse (20-45)
4 Diskussion (46-64)
5 Zusammenfassung (65-66)
6 Literaturverzeichnis (67-76)
7 Anlagen (77-78)
8 Thesen (79-80)