Alexandra Lerchner

Studien zur Gewinnung und gentechnischen Modifizierung von Phospholipase D aus Schlafmohn (Papaver somniferum L.) und Weißkohl (Brassica oleracea var. capitata)

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 12.01.2005

Abstract
Phospholipase D (PLD) katalysiert die Hydrolyse der terminalen Phosphodiesterbindung von Glycerophospholipiden. In Gegenwart eines geeigneten Akzeptoralkohols sind die meisten PLDs außerdem in der Lage, den Phosphatidylrest durch eine sogenannte Transphosphatidylierungsreaktion auf diesen Alkohol zu übertragen.
Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Identifizierung und Sequenzierung der Gene von zwei im Schlafmohn vorkommenden PLD-Isoenzymen, PLD1 und PLD2. Diese bestehen aus 2829 bzw. 2828 bp und enthalten eine Intronstruktur. Wie die anderen PLD-Aktivität aufweisenden Mitglieder der PLD-Superfamilie besitzen die Mohn-PLD-Isoenzyme die bei allen pflanzlichen PLDs vorkommenden konservierten Sequenzbereiche I bis IV, darunter die zwei katalytischen HKD-Motive. Am N-Terminus befindet sich die für die Ca2+-vermittelte Phospholipidbindung verantwortliche C2-Domäne. Beide Enzyme wurden in Escherichia coli in löslicher Form exprimiert und mittels hydrophober Interaktionschromatographie und Ca2+-abhängiger hydrophober Interaktionschromatographie gereinigt. Das pH-Optimum für die Hydrolysereaktion von PLD1 und PLD2 lag bei pH 5,5 bis 6,0. Die optimale Ca2+-Konzentration für beide Enzyme betrug 200 mM. Beide Enzyme besaßen vergleichbare Aktivitäten bei der Hydrolyse, wiesen jedoch signifikante Unterschiede bei der Transphosphatidylierung von Phospholipiden auf, obwohl sich die beiden rekombinanten Mohn-PLDs in nur 11 Aminosäuren voneinander unterscheiden.
Aufbauend auf multiplen Alignments, Sekundärstrukturvorhersagen und Hydrophobizitäts-vergleichen wurden im zweiten Teil dieser Arbeit die Bereiche des ersten und zweiten HKD-Motives, der bei pflanzlichen PLDs hoch-konservierte C-Terminus sowie die 8 in pflanzlichen PLDs ebenfalls hoch-konservierten Cystein-Reste für Mutationsstudien an einer etablierten rekombinanten PLD2 aus Weißkohl ausgewählt. Aufgrund der Messungen der Hydrolyse- und Transphosphatidylierungsaktivitäten der 35 generierten Kohl-PLD2-Enzymvarianten konnten neben der Bestätigung der Bedeutung der HKD-Motive für den Katalysemechanismus, der C-Terminus sowie die hoch-konservierten Cystein-Reste als Strukturelemente identifiziert werden, die einen signifikanten Einfluss auf die hydrolytische Aktivität bzw. die Transphosphatidylierungsaktivität haben.

Phospholipase D (PLD) catalyzes the hydrolysis of glycerophospholipids at the terminal phosphodiester bond. In the presence of a suitable acceptor alcohol, most PLDs are able to transfer the phosphatidyl moiety to this alcohol in a so-called transphosphatidylation reaction.
In the first part of this work two PLD isoenzymes, PLD1 and PLD2, have been identified in opium poppy. The genes consist of 2829 and 2828 bp and contain one intron structure. Like the other members of the PLD superfamily PLD1 and PLD2 contain four conserved regions, including the two HKD motifs being essential for activity. Moreover, the N-terminal C2 domain which is responsible for Ca2+-mediated phospholipid-binding is also found in both poppy PLDs. Both enzymes were successfully expressed in Escherichia coli in soluble form and were purified to homogeneity by hydrophobic interaction chromatography and Ca2+-mediated hydrophobic interaction chromatography. PLD1 and PLD2 showed highest hydrolytic activities at pH 5.5 to 6.0. The optimum Ca2+ concentration was 200 mM for both enzymes. The two enzymes, which differ from each other by eleven amino acids only, have marked differences in transphosphatidylation activity but not in hydrolytic activity.
In the second part of this work both HKD motifs, the C-terminus which is highly conserved in plant PLDs as well as the eight also highly conserved cysteine residues in plant PLDs were chosen as regions for mutational studies of the established recombinant cabbage PLD2. These studies were based on multiple alignments, predictions of secondary structure and comparisons of hydrophobicity profiles. The measurements of the hydrolytic and transphosphatidylation activities of the 35 generated variants of cabbage PLD2 demonstrated the importance of the HKD motifs for the catalytic mechanism. Furthermore, the C-terminus and the cysteine residues could be identified as important structural elements, having a significant influence on the catalysis of the hydrolytic and transphosphatidylation reactions by PLDs.

Keywords:
Phospholipase D, Expression, Mutagenese, Transphosphatidylierung, Hydrolyse, PLD-Superfamilie, HKD-Motive, C2-Domäne, Cystein-Reste, C-Terminus

Phospholipase D, expression, mutagenesis, transphosphatidylation, hydrolysis, PLD superfamily, HKD motifs, C2 domain, cysteine residues, C-terminus

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen und Symbole (1-6)
1 Einleitung und Aufgabenstellung (7-8)
2 Theoretischer Teil (9-27)
3 Materialien (28-36)
4 Methoden (37-54)
5 Ergebnisse und Diskussion (55-98)
6 Zusammenfassung (99-101)
7 Literaturverzeichnis (102-113)
Anhang (114-128)