Martina Körner

Identifizierung und erste Charakterisierung einer neuen Triacylglyceridlipase-Familie aus Arabidopsis thaliana

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 09.11.2005

Abstract
Pflanzen, die in Samen Fette oder Öle einlagern, werden als Ölsaaten bezeichnet und haben in der Landwirtschaft große Bedeutung. Während der Keimung von Ölsaaten werden Speicherfette (Triacylglyceride, TAG) durch TAG-Lipasen (TGL) mobilisiert. In der vorliegenden Arbeit wurden durch den Vergleich mit DNA Sequenzen anderer Organismen potentielle TGL Gene im Genom von Arabidopsis thaliana identifiziert. Die so identifizierten Gene stellen eine neue Genfamilie mit neun Mitgliedern dar, von denen zwei, AtTGL1 und AtTGL2, in Samen und Keimlingen exprimiert werden. AtTGL1 und AtTGL2 wurden in E. coli heterolog exprimiert, und die rekombinanten Enzyme zeigten in vitro TGL Aktivität. Durch heterologe Expression von AtTGL1 und AtTGL2 konnte die Hefe tgl3 Mutante komplementiert werden, die keine endogene TGL Aktivität besitzt. Transiente Expression von Fusionsproteinen aus AtTGL1 und yellow-fluorescent protein ergab eine subzelluläre Lokalisierung an Lipidkörpern von Soja Embryos. Physiologische Funktionen von AtTGL1 und AtTGL2 wurden über einen "loss-of-function" Ansatz in transgenen Pflanzen untersucht, in denen die AtTGL Expression durch antisense-Inhibierung reduziert war. In den antisense-Pflanzen war die Keimlingsentwicklung je nach Stärke der Inhibierung verlangsamt oder arretiert. In Dauerlicht war bei den antisense-Pflanzen nach einem normalen Keimungsverlauf eine Arretierung im Wachstum der Wurzel und in der Gesamtentwicklung zu beobachten. Dieser Effekt konnte durch Angebot von Saccharose ausgeglichen werden. Neben den Effekten bei der frühen Keimlingsentwicklung, zeigten die antisense-Pflanzen verzögerte Blühinduktion und produzierten eine größere Menge an Schoten und Samen als der Wildtyp. Der TAG-Gehalt von antisense-Samen war signifikant erhöht. Aufgrund der gesammelten Daten wird eine Rolle für AtTGL1 und AtTGL2 in der TAG Mobilisierung diskutiert.

Plants that accumulate storage oils in their seeds are termed oilseeds and are of great importance in agriculture. During germination storage oils (triacylglycerols, TAG) are mobilized by TAG-lipases (TGL). In this work similarity searches of the Arabidopsis genome were perfomed according to DNA sequences known from other organisms in order to identify potential TGL genes. The genes identified represent a novel family of nine members, two of which (AtTGL1 and AtTGL2) are expressed in seeds and germinating seedlings. When AtTGL1 and AtTGL2 were expressed heterologously in E. coli, the recombinant enzymes had TGL activity in vitro. Heterologous expression of AtTGL1 and AtTGL2 restored the capability for TAG hydrolysis to the yeast tgl3 mutant. Transient expression of fusion proteins of AtTGL1 and AtTGL2 with yellow-fluorescent protein indicated a subcellular localization on lipid bodies of soybean embryos. Physiological functions of AtTGL1 and AtTGL2 were studied in a loss-of-function approach using antisense plants with reduced AtTGL expression levels. Depending on the degree of transcript reduction, seedling development in the antisense plants was delayed or even arrested. In continuous light conditions the antisense plants exhibited normal germination, but root growth and overall development were arrested. This effect could be overcome by the addition of sucrose. Besides the effects on early seedling development, the antisense plants exhibited a delay in the induction of flowering and generated an increased number of siliques and seeds per plant. The TAG content of antisense seeds was significantly increased. Based on the data collected an involvement of AtTGL1 and AtTGL2 in TAG mobilization is discussed.

Keywords:
Lipase, Triacylglycerol, Lipidkörper, Arabidopsis

lipase, triacylglycerol, oil body, Arabidopsis

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Abkürzungsverzeichnis, Inhaltsverzeichnis (1-5)
Einleitung (6-14)
Material und Methoden (15-34)
Ergebnisse (35-71)
Diskussion (72-82)
Zusammenfassung (83)
Literaturverzeichnis (84-88)
Anhang (89-98)