Ruslana Radchuk

Regulation of seed development in Leguminosae: investigation the role of SNF1-related protein kinase

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 10.10.2005

Abstract
SnRK1 Protein Kinasen (sucrose-non-fermenting-1-related) sind an die Regulation des pflanzlichen Metabolismus beteiligt, mittels Steuerung von Genwirkung und Phosphorylierung.
Eine Voll-Längen -cDNA aus entwickelte sich Samen von V. faba wurde gefunden. Zeitliche und räumliche Expressionsmuster wurden durch Northern-Blot-Hybridisierung in unterschiedlichen Geweben von V. faba analysiert. Um den Effekt des Mangels an SnRK1 zu untersuchen, wurden transgene Erbsen mit einem Gen für VfSnRK1 in antisense Orientierung unter Steuerung des Vicilin Promoter erzeugt. Ausgewählte transgene Linien mit verringerten Gehalt an PsSnRK1-mRNA und verringerter snf1-aktivität wurden weiter charakterisiert.
Um den SnRK1-antisense-Phänotypus auf dem molekularen Niveau zu untersuchen, wurde eine differentielle Genexpressionsanalyse der transgenen und der Wildtyp-Samen mittels macroarray-Analyse durchgeführt. Radioaktiv markierte cDNA-Proben wurden aus RNA von Embryonen sich entwickelnder Samen von Wildtyp (11-21 DAP) und transgenen Pflanzen (13-19 DAP, Übergangsphase der Samenentwicklung) vorbereitet und auf die 4 548 DNA Macroarrayfilter hybridisiert.
Die Signalintensität (entspricht dem relativen mRNA Expressionsniveau) von 131 unterschiedlich exprimierten DNA-Fragmenten wurde einer Clusteranalyse unterzogen. Zwei Hauptgruppen von cDNAs, die eindeutige veränderte Expressionsmuster während der Erbsensamenentwicklung zeigen, wurden durch k-mean clustering identifiziert. Das erste Cluster von EST-Profilen stellt eine Gruppe Genen dar, die in den WT-Samen während der Übergangsphase hochreguliert sind. Das zweites Cluster bilden Genen , die in WT Samen während der Übergangsphase herunterreguliert sind, aber in den transgenen Samen eine verlängerte Expressionsaktivität hatten.
Die folgende allgemeine Zusammenfassunge über die Rolle SnRK1 in der Erbsensamenentwicklung ist möglich: SnRK1 spielt eine Rolle in Zellenzyklusregulation vermutlich durch Vermittlung von Brassinosteroidsignalen sowie durch Regulation der Transkription vieler Zellenzyklusgene auf Ebene des chromatin remodelling. SnRK1 steuert weiterhin ubiquitin-abhängige Proteolyse, Cytokininsignaltransduktion sowie Regulation der Proteinbiosynthese. Unterdrückung von SnRK1-Aktivität unterbricht den ABA-Signaltransduktionsweg.

SnRK1 (sucrose-non-fermenting-1-related) protein kinases are involved in the regulatory machinery of carbon metabolism in plants controlling gene both expression and phosphorylation.
A corresponding cDNA was cloned from developing seeds of V. faba and its specific temporal and spatial expression pattern was analyzed. To study the effect of SnRK1 deficiency, transgenic pea plants were generated carrying a gene for VfSnRK1 in antisense orientation under control of vicilin promoter. Selected transgenic lines were characterized with decreased levels of PsSnRK1 mRNA and reduced snf1-activity.
To dissect the SnRK1-antisense phenotype at the molecular level, a search for genes with differential expression patterns in transgenic plant vs WT seeds has been performed using cDNA macroarray analysis. For this approach radioactive labeled cDNA probes were prepared from RNA isolated from embryo of developing seeds of WT (11-21 DAP) and transgenic plant (13-19 DAP), which correspond to the transition phase of seed development, and hybridized to 4 548 pea cDNA macroarrays.
Signal intensities of 131 differentially expressed cDNA fragments were subjected to cluster analysis. Two major groups of cDNA fragments, showing distinct expression patterns during pea seed development were created by k-mean clustering: a group of genes, which are up-regulated in WT seeds during the transition phase and showed retarded induction of these genes and groups of genes, which are down-regulated in WT during the transition phase but showed prolonged expression activity in transgenic seeds.
After analysis of differentially expressed cDNA fragments, the following general conclusions about the role SnRK1 in pea seed development is possible: SnRK1 is involved in cell cycle regulation probably by mediation of brassinosteroide signal transduction and regulation of transcription of many cell cycle genes at the level of chromatin remodelling. SnRK1 is involved in ubiquitin-dependent proteolysis and cytokinin signal transduction and regulation of protein synthesis. Repression of SnRK1 causes interruption of ABA signals.

Keywords:
SnRK1, Carbonmetabolismus, Samenentwicklung, ABA Signalübertragung, Leguminosae, Antisense-Repression, Macroarrayanalyse

SnRK1, carbon metabolism, seed development, ABA signal transduction, leguminosae, antisense-repression, macroarray analysis

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Inhaltsverzeichnis
Title page, Contents, List of abbreviations
1. Introduction (1-16)
2. Material (17-23)
3. Methods (24-34)
4. Results (35-73)
5. Discussion (74-91)
6. Abstract (92-94)
7. Zusammenfassung (95-97)
8. References (98-112)
9. Appendix (113-121)
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