Knut Kölbel

Dynamik einer lokalen Strukturregion von Phospholipase A2 aus Schweinepankreas und ihr Einfluss auf die Stabilität des Enzyms

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 08.11.2006

Abstract
Phospholipase A2 aus Schweinepankreas (PLA2) gehört zu einer Klasse ubiquitärer Proteine, die spezifisch die hydrolytische Spaltung von 1,2-Diacylglycerophospholipiden an Position 2 zu Lysophospholipiden und freien Fettsäuren katalysieren. Das Enzym besteht aus 124 Aminosäuren, darunter 14 Cysteine, die sieben Disulfidbrücken bilden. Seine Größe beträgt 13,9 kDa, der isoelektrische Punkt 7,5. Für die Hydrolysereaktion ist neben der katalytischen Dyade aus Histidin 48 und Aspartat 99 die Koordinierung eines Calciumions durch den Aspartatrest 49 sowie das Polypeptidrückgrat des so genannten Calciumbindungs-loops essentiell. PLA2 wird, wie auch andere Phospholipasen A2, durch Bindung an Substrate in aggregierter Form ( z. B. Vesikel oder Micellen) aktiviert. Hierfür ist eine vom aktiven Zentrum verschiedene, als interface recognition site (irs) bezeichnete Oberflächenregion verantwortlich. Der N-Terminus von PLA2 ist ein Bestandteil der irs und bei sauren sowie neutralen pH-Werten über ein extensives Wasserstoffbrückennetzwerk mit dem aktiven Zentrum verbunden.
Fluoreszenzspektroskopische Messungen der globalen Stabilität von PLA2 im Gleichgewicht zeigten, dass das Enzym aufgrund einer wenig ausgeprägten Kooperativität der Entfaltung in Gegenwart von Denaturanzien, trotz seiner extrem hohen Denaturansresistenz, eine besonders bei basischen pH-Werten vergleichsweise geringe thermodynamische Stabilität aufweist. Stabilitätsmessungen anhand des HD-Austausches, der mittels NMR verfolgt wurde, bestätigten diesen Befund. Mit Hilfe spektroskopischer Messungen und von NOESY-NMR-Spektren konnte gezeigt werden, dass PLA2 je nach Calciumkonzentration und vorliegendem pH-Wert in mindestens zwei verschiedenen nativen Konformationen vorliegt. Der eingangs erwähnte N-Terminus des Enzyms ist mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit in diesen Vorgang involviert. Durch die Bestimmung thermischer Übergangskurven unter verschiedenen Bedingungen, der Geschwindigkeitskonstanten der globalen Entfaltung als auch der des N-Terminus mittels limitierter Proteolyse konnte belegt werden, dass die erhöhte Dynamik der nativen Struktur, insbesondere des N-Terminus bei basischen pH-Werten die thermodynamischen Stabilitätsparameter entscheidend beeinflusst.

Porcine pancreatic phospholipase A2 (PLA2) belongs to a class of ubiquitous proteins that catalyze the specific hydrolytic cleavage of 1,2-diacylglycerophospholipids at position 2 to lysophospholipids and free fatty acids. The enzyme consists of 124 amino acids, 14 of which are cysteines, constituting the protein's seven disulfide bridges. It has a molecular weight of 13.9 kDa and an isoelectric point of 7.5. The coordination of one calcium ion by residue D49 and the so called calcium binding loop is essential for catalysis, as does the catalytic dyad of H48 and D99. Like many other phospholipases A2, PLA2 is activated by substrates beeing in an aggregated state (i.e. micelles or vesicles). A surface region, distinct from the active site, the so called interface recognition site (irs), is responsible for this activation. The active site of the enzyme is connected to the N-terminus of PLA2, some residues of which contribute to the irs by an extensive H-bonding network.
Despite its extremely high resistance against denaturants, the enzyme has a comparatively low thermodynamic stability due to its barely pronounced cooperativity of unfolding, especially at basic pH-values, as shown by spectroscopic measurements of PLA2's global stability in the presence of denaturants. These results were further approved by stability determinations on the basis of HD-exchange monitored by NMR. Spectroscopic measurements and NOESY-NMR-spectra at various pH-values revealed, that PLA2 exists in at least two different conformations, depending on the calcium concentration and the actual pH-value. The N-terminus of the enzyme is certainly involved in this event. Thermal transition curves under various conditions as well as the protein's global and local unfolding rate constants obtained by limited proteolysis revealed that the parameters of PLA2's thermodynamic stability are decicively influenced by the accelerated dynamics of the protein's native structure, especially of the N-terminus at basic pH-values.

Keywords:
PLA2, globale Entfaltung, lokale Konformationsänderung, N-terminale α-Helix, Circulardichroismus, intrinsische Fluoreszenz, ANS-Fluoreszenz, stopped-flow-Fluoreszenz, NOESY-NMR, limitierte Proteolyse

PLA2, global unfolding, local conformational shift, N-terminal α-helix, circular dichroism, intrinsic fluorescence, ANS-fluorescence, stopped-flow-fluorescence, NOESY-NMR, limited proteolysis

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1, 1-4)
1 Einleitung und Aufgabenstellung (5-6)
2 Theoretischer Teil (7-32)
3 Materialien und Methoden (33-43)
4 Ergebnisse und Diskussion (44-95)
5 Zusammenfassende Diskussion (96-100)
6 Tabellarischer Anhang (101-110)
Literaturverzeichnis (111-119)