Diana Weier

Die Sinapoylglucose: Cholin-Sinapoyltransferase aus Brassica napus

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 02.11.2006

Abstract
In Samen von Brassicaceen akkumulieren Ester der Sinapinsäure mit Sinapoylcholin (Sinapin) als Hauptkomponente. Durch ihren phenolischen Charakter sind diese Inhaltsstoffe in einigen Nutzpflanzen, wie z.B. Raps (Brassica napus), als antinutritive Substanzen unerwünscht. Eine Möglichkeit zur Verringerung des Sinapingehaltes besteht in der samenspezifischen Suppression der Sinapinbiosynthese. Dazu sind neben der Kenntnis der beteiligten Gene, Informationen zu Regulation, Metabolitenfluss und Kompartimentierung notwendig. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen die Klonierung, Charakterisierung und Lokalisierung einer Sinapoylglucose:Cholin-Sinapoyltransferase (BnSCT1; Sinapinsynthase) aus B. napus. Ausgehend von einem cDNA-Fragment, das Sequenzähnlichkeit zu Acyltransferase-Genen aufwies, konnten aus B. napus vier BnSCT-cDNAs isoliert werden. Die Funktionalität von BnSCT1 wurde durch die Komplementation einer SCT-defizienten A. thaliana-Mutante sowie durch Expression enzymatisch aktiver SCT in S. cerevisiae und N. tabacum bestätigt. Expressionsanalysen zeigten eine direkte Korrelation von BnSCT1-Transkriptmenge und gemessener Enzymaktivität während der Samenentwicklung. Aus der upstream Region des BnSCT1-Gens wurde ein DNA-Fragment isoliert und mit dem GUS-Reportergen fusioniert. Transformierte Arabidopsis-Pflanzen zeigten samenspezifische Promotoraktivität. Durch dsRNAi-vermittelte samenspezifische Suppression der SCT wurde in Arabidopsis eine Reduktion des Sinapingehaltes um etwa 50 % erreicht. Mit Hilfe eines Peptidantikörpers konnte das BnSCT1-Proteinin der Aleuronschicht und im embryonalen Gewebe nachgewiesen werden. Die Signale deuten auf eine subzelluläre Lokalisation im Stroma der Plastiden hin.

Members of the Brassicaceae family accumulate sinapate esters in their seeds with sinapoylcholine (sinapine) as major component. In crop plants like oilseed rape (Brassica napus), these phenolic compounds are considered as antinutritive. A reduction of the sinapine content in oilseed rape can be achieved by seed-specific suppression of sinapine biosynthesis. This approach requires the identification of involved genes as well as information about regulation, metabolic fluxes and compartmentalisation of sinapine biosynthesis.This work deals with cloning, characterization and localization of sinapoylglucose:cholinesinapoyltransferase (BnSCT1; sinapine synthase) from B. napus.
By homology-based cloning, four BnSCT-cDNAs were isolated. The function of the protein encoded by BnSCT1 was demonstrated by complementation of an SCT deficient A. thaliana mutant and by expression of an enzymatically active SCT in S. cerevisiae und N. tabacum. The transcript level of BnSCT1 paralleled the changes in SCT activity during seed development of B. napus. A genomic upstream fragment of BnSCT1 was fused to the GUS reporter gene and shown to mediate promoter ativity in seeds of Arabidopsis. The seed-specific dsRNAi suppression of SCT in Arabidopis resulted in a reduction of the sinapin content to about 50 %. Immunolocalisation studies with a peptide antibody recognizing the BnSCT1 protein detected the enzyme in the aleuron layer and in embryonic tissues. The signals indicate a sub-cellular localisation of BnSCT1 in the stroma of plastids.

Keywords:
Sinapin, Sinapoylcholin, Sinapatester, Suppression, Sinapoylglucose:Cholin-Sinapoyltransferase (SCT), Acyltransferase, SCPL-Protein, Brassica napus, Raps, Samen

sinapine, sinapoylcholine, sinapate ester, suppression, sinapoylglucose:choline-sinapoyltransferase (SCT), acyltransferase, SCPL protein, Brassica napus, oilseed rape, seed

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abbildungsverzeichnis, Tabellenverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1, I-VIII)
1. Einleitung (1-11)
2. Material und Methoden (12-43)
3. Ergebnisse (44-76)
4. Diskussion (77-90)
5. Zusammenfassung (91-92)
6. Literaturverzeichnis (93-104)
A. Anhang (105-122)
Publikationen, Poster und Vorträge