Sebastian Schornack

Struktur, Erkennungsspezifität und Regulationsmechanismus des Resistenzproteins Bs4 aus Tomate

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 14.12.2006

Abstract
Das Resistenz (R)-Gen Bs4 aus Tomate (Lycopersicon esculentum) vermittelt Resistenz gegen Stämme des Erregers der Bakteriellen Fleckenkrankheit Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), die das Avirulenz (Avr)-Protein AvrBs4 exprimieren. Bs4 ist konstitutiv schwach exprimiert und kodiert für ein cytoplasmatisches Protein mit einer aminoterminalen Toll/Interleukin1-Rezeptor-ähnlichen (TIR)-Domäne, einer Nukleotidbindedomäne (NB) und carboxyterminalen Leucin-reichen Wiederholungen (LRR). Bs4 induziert in mehreren Pflanzenarten bei gemeinsamer Agrobacterium-vermittelter transienter Expression mit kern- bzw. cytoplasmatisch lokalisierten AvrBs4-Derivaten eine hypersensitive Reaktion (HR), die unabhängig von Kernlokalisierungssequenzen in AvrBs4 ist. Für die HR sind die Signalkomponenten EDS1, SGT1 und Hsp90 notwendig. Bs4 vermittelt auch die Erkennung von Hax3 und Hax4, zwei AvrBs3-ähnlichen Proteinen, sowohl bei Xcv-vermittelter Translokation, als auch bei niedriger Expression unter Bs4-Promotor-Kontrolle. Dagegen erfolgt AvrBs3-Erkennung nur bei Überexpression. Um zu testen, ob Bs4-Domänen intramolekulare Interaktionen eingehen können, wurden die Bs4-Domänen-Derivate in planta exprimiert. Durch Expression von TIR und NB-LRR in trans wurde eine AvrBs4-spezifische HR induziert. Außerdem interagierten TIR- und NB-LRR-Domäne bzw. TIR-NB- und LRR-Domäne miteinander, was auf intramolekulare Interaktionen in Bs4 hindeutet. Diese Domänen-Interaktionen sind in Gegenwart von AvrBs4 nicht mehr nachweisbar. Außerdem werden die Protein-Mengen von Bs4 und Bs4-Domänen, die allein keine HR auslösen, stark reduziert. Diese AvrBs4-induzierten Effekte weisen auf eine Zustandsänderung des Bs4-Proteins hin. Um die Rolle von Hsp90 bei der Bs4-vermittelten Resistenz zu analysieren, wurden Überexpressions- und Silencing-Experimente gekoppelt mit phänotypischen und biochemischen Analysen durchgeführt. Hsp90 interagiert mit Bs4 und Hsp90 ist notwendig für detektierbare Bs4-Mengen. Sowohl Silencing als auch Überexpression von Hsp90 hemmt die Bs4-HR und die HRs anderer NB-LRR-Proteine. Hsp90-Überexpression führt zu mehr Bs4 und bremst den AvrBs4-induzierten Abbau von Bs4. Dieser Abbau erfolgt nicht über Polyubiquitinierung, da deren Inhibierung durch Expression der Ubiquitin-Mutante ubR48 den Bs4-Abbau nicht stoppt. Vielmehr sind die Bs4-Mengen dann bereits ohne AvrBs4 stark reduziert. Die Expression von ubR48 beeinträchtigt auch die HRs anderer NB-LRR-Proteine.

The tomato (Lycopersicon esculentum) Bs4 disease resistance (R)-gene mediates resistance towards strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), the causal agent of bacterial spot disease, that express the avirulence (Avr) protein AvrBs4. Bs4 is constitutively expressed at low levels and encodes a cytoplasmic R-protein consisting of an amino terminal Toll/Interleukin1-like (TIR) domain, a central nucleotide binding site (NB) and carboxy terminal leucine rich repeats (LRR). Bs4 induces a hypersensitive response (HR) upon transient Agrobacterium mediated coexpression with nuclear or cytoplasmically localized AvrBs4 derivatives in tomato, Nicotiana benthamiana and other plant species independent of Avr encoded nuclear localisation sequences. This HR requires the signaling components EDS1, SGT1 and Hsp90. Bs4 also mediates recognition of Hax3 and Hax4, two other AvrBs3-like proteins upon Xcv type III-dependent translocation as well as low-level transient expression driven by the Bs4 promoter. By contrast, AvrBs3 requires to be overexpressed to trigger Bs4-HR.
Bs4 domains were expressed in planta to address whether they interact in trans, indicating intramolecular interactions. Indeed, Bs4 TIR and NB-LRR domain derivatives conferred AvrBs4-induced HR upon expression in trans. Furthermore the TIR interacts with the NB-LRR domain and the TIR-NB interacts with the LRR domain in planta, and these interactions are resolved in presence of AvrBs4. Protein levels of Bs4 and also Bs4 domains that are alone incapable of eliciting HR decline AvrBs4-dependently pointing towards a state transition of the Bs4 protein.
Hsp90 interacts with Bs4 and is required to maintain detectable Bs4 amounts. Both, silencing and overexpression of Hsp90 inhibit the Bs4 HR and HRs of other NB-LRR proteins. Conversely, Hsp90 overexpression results in increased Bs4 levels and blocks the Avr induced disappearance of Bs4. This does not involve polyubiquitinatiation, as ubR48 expression that blocks polyubiqutination does not prevent disappearance. Instead, ubR48 expression attenuates Bs4 levels independent of AvrBs4. Expression of ubR48 does not only interfere with Bs4 but also with HRs triggered by other NB-LRR proteins.

Keywords:
Tomate, Xanthomonas, Agrobacterium, Solanaceae, Bs4, TIR-NB-LRR, Hsp90, Ubiquitin, Signaltransduktion, AvrBs3, AvrBs4

tomato, Xanthomonas, Agrobacterium, nightshade, Bs4, TIR-NB-LRR, Hsp90, Ubiquitin, signal transduction, AvrBs3, AvrBs4

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Zusammenfassung, Summary, Inhalt, Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen (1, I-VI)
1. Einleitung (1-15)
2. Ergebnisse (16-99)
3. Diskussion (100-115)
4. Literatur (116-127)
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen (128)
Veröffentlichungen