Michael Rother

Untersuchungen zur assimilatorischen Sulfatreduktion in Physcomitrella patens: Analyse von Transkripten, Metaboliten und Enzym

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 03.05.2007

Abstract
In der vorliegenden Arbeit wurden mit den Analysen zum Einfluss von Cd(II) auf die Expression von Genen der Cystein- und Glutathion-Biosynthese erstmals molekularbiologische Untersuchungen an einem Moos unter Schwermetall-Stress durchgeführt. Bisherige Studien wurden ausschließlich an höheren Pflanzen vorgenommen. Da diese unter Schwermetall-Stress Phytochelatine (PC) bilden, war die Untersuchung einer niederen Pflanze, welche von Natur aus keine PC synthetisiert, von großem Interesse. Bereits in früheren Studien wurde nachgewiesen, dass schwermetallgestresste Moose einen Anstieg des Glutathionspiegels aufweisen. Aufgrund dieser Beobachtungen wird eine entscheidende Rolle von Glutathion (GSH) als Chelator zur Schwermetall-Detoxifikation bei Bryophyten postuliert. Weil es auch in Cd(II)-behandelten Physcomitrella patens zu einer Erhöhung des GSH-Pools kommt, stand die Charakterisierung der Transkription von Genen der Sulfatassimilation und GSH-Biosynthese im Mittelpunkt der Arbeit. Zudem sollten Faktoren untersucht werden, welche bereits in der Literatur mit der Schwermetall-Homöostase in Verbindung gebracht wurden. Hierbei war die Gentranskription von Metallothioneinen und GSH-S-Transferasen von großer Bedeutung. Untersuchungen zur Expression von Genen, die Enzyme der Redox-Homöostase kodieren, sollten klären, ob Cd(II) oxidativen Stress verursacht. Die Resultate wurden durch Bestimmung des als Marker für den Redox-Status bezeichneten GSH/GSSG-Verhältnisses ergänzt. Den Ergebnissen der Transkriptionsstudien wurden Untersuchungen zur Aktivität von Enzymen der Cys- und GSH-Biosynthese bzw. Glutathion-S-Transferasen beigestellt. Da die Ergebnisse zur Genexpression und Enzymaktivität nur auf die intrazellulär wirksame Cd(II)-Konzentration zurückzuführen sind, war eine Bestimmung der Cd(II)-Adsorption und Cd(II)-Bioakkumulation von P. patens notwendig. Die Studien wurden durch Untersuchungen zur Vitalität und zellulären Cd(II)-Verteilung ergänzt.

In the present study, the influence of Cd(II) on the transcription of genes involved in cystein (Cys) and glutathione (GSH) biosynthesis was investigated for the first time in a moss under heavy metal stress. Previous studies were exclusively carried out on higher plants. Because these organisms are synthesizing phytochelatins (PC) in respect to heavy metals, the analysis of a naturally PC-less plant was of special interest. Earlier studies on bryophytes have already shown that mosses react with increased GSH pools upon heavy metal exposure, leading to the hypothesis that GSH itself is involved in heavy metal detoxification in these plants. Because Physcomitrella patens is also showing a higher GSH level upon Cd(II) exposure, the characterization of transcript levels of Cys and GSH biosynthesis genes were the main target of this work. In addition, factors had to be analyzed, which were connected with heavy metal tolerance. These include not only the involvement of metallothioneins (MT) and glutathione S transferases (GST) but also enzymes needed for redox homeostasis. Measurements of the redox state (GSH : GSSG ratio) were necessary to control, if Cd(II) is causing oxidative stress in P. patens. To confirm the transcript results, activities of key enzymes of Cys and GSH biosynthesis and GST were investigated. Because expression and enzyme assay results are based on the intracellular heavy metal concentration, Cd(II) biosorption and bioaccumulation were determined. This work was supplemented by studies on chlorophyll content and photosystem II activity after Cd(II) stress.

Keywords:
Glutathion, Cadmium, Physcomitrella patens, Sulfatassimilation, Cystein, Schwermetalle

glutathione, cadmium, Physcomitrella patens, sulfate assimilation, cystein, heavy metals

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1, i-vi)
1 Vorwort (7)
2 Einleitung (8-22)
3 Materialien und Methoden (23-40)
4 Ergebnisse (41-74)
5 Diskussion (75-97)
6 Zusammenfassung und Ausblick (98-101)
7 Literatur (102-114)
Anhang (i-xvi)