Marco Kliemannel

Die Pro-Form des Nervenwachstumsfaktors NGF: Biophysikalische Charakterisierung der Strukturbildung

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 27.04.2007

Abstract
Der Nervenwachstumsfaktor NGF, Mitglied der Neurotrophinfamilie reguliert und stimuliert Wachstum, Differenzierung und Überleben von neuronalen Zellen. NGF wird als Pro-Protein (ProNGF) synthetisiert, gewebespezifisch posttranslational zu reifem NGF prozessiert und sekretiert. Im Gegensatz zum reifen Wachstumsfaktor, für den eine proliferative Wirkung bekannt ist, wird für ProNGF eine proapoptotische Aktivität postuliert. Weder die Struktur des Pro-Peptids noch die Art der Wechselwirkung des Pro-Peptids mit dem reifen Teil waren dabei zu Beginn der Arbeit bekannt.
Es wurde nachgewiesen, dass die Gegenwart des Pro-Peptids keinen Einfluss auf die langsame Entfaltung des reifen NGF besitzt. Dabei konnte die langsame Entfaltung von NGF, welche in der Literatur fälschlich mit einem Entfädeln der Disulfidbrücken des Cystin-Knotens erklärt wurde ("loop-threading"-Hypothes ) auf die Auflösung einer Reststruktur in räumlicher Nähe des Cystin-Knotens zurückgeführt werden. Die Charakterisierung des isolierten Pro-Peptids zeigte, dass die isolierte Form im Gegensatz zum NGF-gekoppelten Pro-Peptid keine stabilisierende Tertiärstruktur aufweist. Während der Denaturierung und Renaturierung des NGF-gekoppelten Pro-Peptids konnten zwei Faltungsintermediate identifiziert und charakterisiert werden. Daneben konnte innerhalb des Pro-Peptids eine Region und innerhalb der NGF-Domäne eine Aminosäurerest identifiziert werden, welche voraussichtlich an der Interaktion zwischen NGF und Pro-Peptid beteiligt ist. Dabei wurde mit der Aminosäurerest innerhalb des NGF ein Bereich identifiziert, welcher auch an der Assoziation von NGF an den Rezeptoren p75 und TrkA beteiligt ist. Dies würde die in der Literatur beobachtete verminderte Affinität von ProNGF zu diesen Rezeptoren erklären.

The nerve growth factor NGF belongs to the neurotrophin protein family and promotes growth, maintenance and differentiation of neuronal cells. NGF is synthesized as a pro-protein (ProNGF) and secreted upon tissue specific processing to mature NGF. In contrast to NGF, which is known with cell proliferative function ProNGF acts probably as pro-apoptotic molecule. Neither the structure of the pro-peptide nor the type of interaction between pro-peptide and the mature domain is unknown for NGF and all neurotrophins.
It could be demonstrated, that the presents of the pro-peptide has no influence to the very slow unfolding of the NGF domain. Thereby, the slow unfolding of NGF, which was described as an unthreading of the cystine knot (loop-threading hypothesis), could be explained by a loss of the residue structure, which is located near the cystine knot. The characterisation of the isolated pro-peptide and the NGF-coupled pro-peptide showed that only the NGF-coupled pro-peptide contains stabilising tertiary contacts. Two folding intermediates could be identified and characterised during the folding and unfolding of NGF-coupled pro-peptide. Furthermore, a region inside the pro-peptide and an amino acid residue inside the mature part could be identified, which are involved in the pro-peptide NGF interaction. Thereby, this amino acid residue inside the NGF is also a part of the receptor association of NGF to TrkA and p75, which explains the observed lower binding affinity of ProNGF to those receptors.

Keywords:
Nervenwachstumsfaktor NGF, ProNGF, Cystin-Knoten, Pro-Peptid, Proteinfaltung, Intermediat, Rezeptorbindung, Sortilin, TrkA, p75

nerve growth factor NGF, proNGF, cystine knot, pro-peptide, protein folding, intermediate, receptor binding, Sortilin, TrkA, p75

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis (1,1)
1 Zusammenfassung (2-3)
2 Einleitung & Hintergrund (4-18)
3 Ergebnisse (19-34)
4 Veröffentlichungen (35-63)
Anhang (64-77)